高选择性不对称还原N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺的重组氧化还原酶催化性质及其酶促转化

摘要

通过表达多种重组立体选择性氧化还原酶,分析其催化不对称还原N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DKTP)的性质,从而构建酶促合成(S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DHTP)的反应体系.基于已有立体选择性氧化还原酶重组大肠杆菌,通过Ni离子亲和层析法纯化得到重组氧化还原酶,以DKTP为底物,考察不同重组氧化还原酶对DKTP的催化活性和选择性,进一步对高选择性酶促合成(S)-DHTP的重组酶CR2进行性质分析,并考察其在最适条件下不对称还原DKTP的过程.筛选获得产物构型为(S)-型的催化活性最高的酶为CR2,该酶米氏常数Km为0.135mmol/L,Kcat/Km为3.689L/(mmol·s),最适pH8.4(0.1mol/L三乙醇胺缓冲液),最适反应温度为35°C,在10-45°C条件下和pH7.5-8.5较为稳定,Zn2+离子对酶活有促进作用.CR2催化DKTP不对称还原反应6h后,DHTP的产率达92.1％、光学纯度达99.9％.基于活性和选择性分析,获得不对称还原DKTP的目标酶CR2,其催化特性有利于高立体选择性还原DKTP生成度洛西汀中间体(S)-DHTP,从而为进一步提高酶促不对称还原DKTP的转化效率提供研究基础.