慢阻肺患者肺泡灌洗液宏基因组DNA的制备方法

摘要

从慢阻肺稳定期患者的支气管肺泡灌洗液(BALF)标本中提取微量的宏基因组DNA,以便于后续的PCR反应和测序进行菌群分析.取3例慢阻肺稳定期患者的BALF各5ml,13000 r/min、4℃离心30 min收集细胞,按照改良Qiagen DNA提取试剂盒的操作步骤进行提取,加入Buffer ATL后,首先用研磨珠和多功能生物样品匀质器破碎革兰阳性菌的菌壁,再加入蛋白酶K,55℃孵育1 h,然后加入Buffer AL振荡混匀.加入无水乙醇混匀后，将全部溶液过柱，用500μl的Buffer AW1洗柱1次，再加入500 μl的Buffer AW2洗柱1次，最后加入50 μl的Buffer AE洗脱DNA。提取的DNA用Qubit. dsDNA BR Assay Kit试剂盒定量，通过PCR方法检测样本中的细菌16S DNA含量进一步验证。结果表明，改良后3例BALF的DNA浓度分别为15.5,25.0和60.8mg/L，明显高于单纯按照试剂盒操作步骤提取的DNA浓度(1,7.6和42.9mg/L，并且所提取的DNA可以很好地进行菌群16S的PCR扩增，改良后的PCR扩增产物明显多于改良前。结论:改良后的DNA提取方法能够更高效地提取BALF中的宏基因组DNA，为进一步测序和菌群分析打下基础。