生防菌株CQBs03-GFP在柑橘叶围的定殖能力

摘要

本研究根据枯草芽抱杆菌标准菌株Bs168的p43启动子和加基因序列分别设计两对特异引物p43F、p43R和gfpF、gfpR、PCR扩增获得了完整的启动子p43和gfP基因序列。进一步以上述PCR产物为模板，以p43F、gfpR为引物进行重迭PCR，获得外源蛋白表达盒P43-gfp，纯化后经BamHI和EcoRI完全酶切后与相同限制性内切酶线性化处理的大肠杆菌一枯草芽胞杆菌穿梭载体pHY300PLK连接，构建重组表达质粒pHY43G，采用PCR和限制性内切酶酶切验证重组质粒的正确性，并且进行DNA测序，确保序列无突变;将获得的重组质粒以电脉冲的方法转化枯草芽抱杆菌感受态细胞;阳性转化子实验室发酵培养后于荧光显微镜下观察并通过SDS-PAGE分析外源蛋白的表达情况;然后对重组菌株进行生长动力学分析、传代稳定性测试并进行与柑橘溃疡病菌的平板对峙培养实验:在自然条件下，通过喷雾生防菌BS03、BS03-pHY43G和致病菌Xac01的菌悬浮液，通过定期取样，平板系列稀释法回收、计数并结合荧光定量PCR检测，侧定了CQBs03、CQBs03-pHY43G和XCO1在柑橘植株体表的定殖动态。结果表明重组菌株在营养期可以大量组成型表达GFP，属于可溶性表达;荧光显微镜暗视野下以蓝光激发后可以明显的观察到杆状菌体发出的绿色荧光;SDS-PAGE后同出发菌株相比出现了明显的大约29KDa的特异蛋白条带;使用BANDSCAN 5.0软件分析发酵24h时的电泳图谱的灰度表明GFP的积累量占细胞可溶性蛋白的67%;生长动力学测试表明外源质粒未对宿主菌的生长带来明显不利影响;质粒稳定性实验(连续稀释培养30次)表明重组质粒稳定性为51%;室内平板抑菌实验结果显示CQB s03-pHY43G生防效果与出发菌株没有明显差异;CQBs03-pHY43G在柑橘植株上接种60d后仍能检测到;通过分析在自然环境下枯草芽抱杆菌EGF重组菌株与柑橘溃疡病菌的消长关系分析，重组菌株有一定的抑菌效果。