猪PD-1和PD-L1胞外区基因的克隆、鉴定及原核表达

摘要

为了研究PD-1/PD-L1通路在猪免疫抑制病中的作用，根据GenBank中猪PD-1和PD-L1的基因序列及原核表达载体多克隆酶切位点，设计其胞外区引物，以猪外周血单个核细胞(PMBC)cDNA为模板，应用PCR技术扩增PD-1、PD-L1片段，并与pMD18-T-simple载体连接转化至DH5α中，通过菌液PCR及测序鉴定正确后，利用限制性内切酶分别对质粒pMD-PD-1、pMD-PD-L1及原核表达载体进行双酶切，利用T4 DNA连接酶连接纯化回收的酶切产物，连接产物转化至DH5α中，经鉴定正确后转化至Rosetta中进行诱导表达，然后对表达产物进行SDS-PAGE电泳检测和Western blot分析。实验结果表明，通过PCR扩增获得了366bp的PD-1基因和645bp的PD-L1基因。成功构建了重组表达载体pET-PD1和pET-PDL1，经SDS-PAGE分析，在28℃,O.5mmol/L IPTG条件诱导下获得了33ku左右的PD-1蛋白。在37℃,O.5mmol/L IPTG条件诱导下获得了43ku左右的PD-L1蛋白。两种蛋白均以包涵体形式存在。Western blot分析结果表示两个蛋白均能被其标签抗体所识别，也能被同源性较高的人的PD-1、PD-L1单抗所识别，说明表达出的蛋白有良好的反应原性。本研究成功克隆出了猪PD-l、PD-L1胞外区目的基因，并表达获得了其目的蛋白，为其单克隆抗体的制备及PD-1/PD-L1通路在猪免疫抑制病中的作用奠定基础。