徐长卿丹皮酚对兔膝骨性关节炎软骨基质金属蛋白酶及其抑制剂的影响

摘要

目的:骨性关节炎是骨科领域最常见的关节病变,随着我国老龄化进程的发展,OA的发病率会不断升高,严重影响了中老年人的生活质量.骨性关节炎的主要病理学变化为关节软骨不同程度退行性变性或消失,以及软骨下骨质破坏.病理研究证实,关节软骨软骨变性是骨性关节炎特征性病理改变,也是OA最根基的病理改变.有关软骨退变机制及其细胞和分子基础成为近年来研究的热点.本课题利用徐长卿丹皮酚对基质金属蛋白酶的影响作为切入点,从细胞形态、电镜下超微病理结构的改变、分子生物学三个层面探讨徐长卿丹皮酚治疗骨性关节炎的作用机理,为临床推广徐长卿丹皮酚治疗骨性关节炎提供理论和实验依据.rn 方法:40只体重2kg(±1OOg)健康新西兰成年大耳白兔,雌雄不限,随机分为正常组、对照组、生理盐水组、曲安奈德组、徐长卿丹皮酚组,每组8只.随机选取8只作为正常组,其余32只采用兔膝关节内侧半月板前1/3切除及前交叉韧带切断(ACLT)制备骨关节炎(OA)模型方法进行造模,4周后造模成功.正常组:不作任何治疗.对照组:仅采用兔膝关节内侧半月板前1/3切除及前交叉韧带切断(ACLT)制备骨关节炎(OA)模型方法进行造模,不予其它处理.生理盐水组、曲安奈德组、徐长卿丹皮酚组:造模术后第1周开始各组分别予以右膝关节内注射0.9％生理盐水、曲安奈德、徐长卿丹皮酚各0.2ml,2次/周,共10次,给药5周.各组动物分别于完成5周用药疗程后,耳缘静脉缓慢注入适量空气处死,暴露膝关节腔.①关节软骨肉眼观察表面光滑度、色泽、表面糜烂程度、是否有纤维性增生及软骨下骨暴露等形态学改变,拍照并按大体评分标准评分;取制备好的股骨内侧髁关节软骨标本,透射式电子显微镜下进行超微结构观察并拍照.②取右侧股骨内侧髁关节面约2mm厚关节软骨标本制作成石蜡切片后,两步法免疫组化染色,置光镜下对其组织结构进行详细的观察,并参照Mankin关节软骨病理评分标准进行积分统计Mankin评分,包括关节软骨结构,细胞数的变化,潮线的完整性及易染性四个方面;统计学分析关节软骨基质金属蛋白酶(MMP-1)和其抑制剂(TIMP-1)表达的阳性指数.③采用RNA原位杂交方法利用MMP-1和TIMP-1寡核苷酸探针,对兔关节软骨MMP-1和TIMP-1 mRNA作定位和定量分析,检测兔膝关节骨性关节炎软骨组织MMP-1和TIMP-1 mRNA表达.rn 结果:①大体观察示正常组关节面光滑完整.对照组软骨改变集中在股骨内侧髁关节面,关节软骨有虫蚀样改变和软骨剥脱缺损.生理盐水组软骨表面粗糙,肥厚.徐长卿丹皮酚组关节面略粗糙,软骨轻度糜烂.曲安奈德组软骨糜烂程度较徐长卿组重,有的可见软骨下骨暴露.电镜观察示正常组细胞形态正常,胞核完整,胞浆密度均匀,可见大量细胞器,细胞表面的绒毛和胶原清晰可见.对照组大多数软骨细胞形态不规则,胞质内细胞器溶解,胶原排列紊乱.生理盐水组大部分软骨细胞肿胀明显.徐长卿组:细胞形态尚存,胶原轻度紊乱,胞质内粗面内质网丰富.曲安奈德组:呈颗粒状外观,细胞质内部分细胞器溶解,胶原纤维含量较少.②组织学观察示正常组Mankin评分0-1分;徐长卿丹皮酚组以轻度至中度损伤为主,Mankin评分4-6分;曲安奈德组以中等软骨损伤为主,Mankin评分8-10分;造模组以重度软骨损伤为主,Mankin评分11-12分;生理盐水组与造模组相似.徐长卿丹皮酚组软骨组织MMP-I表达的阳性指数较正常组增高,较曲安奈德组和造模组低,组间比较有统计学意义(P＜0.05);徐长卿丹皮酚组软骨组织TIMP-1表达水平较曲安奈德组增高,两组间比较差异有统计学意义(P＜0.05),曲安奈德组TIMP-1表达水平与造模组、生理盐水组组间比较无统计学差异(P＞0.05).⑧正常组关节软骨MMP-1和TIMP-1 mRNA表达均低下或无表达;徐长卿丹皮酚组软骨组织MMP-1和TIMP-1mRNA表达均较低;曲安奈德组软骨组织MMP-ImRNA表达明显增强;造模组关节软骨MMP-1mRNA表达最强,TIMP-1mRNA全层无表达或低下;徐长卿丹皮酚组软骨组织MMP-1mRNA表达水平较正常组增高,较曲安奈德组和造模组低,组间比较有统计学意义(P＜0.05);徐长卿丹皮酚组软骨组织TIMP-1 mRNA表达水平较曲安奈德组增高,两组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).rn 结论:实验结果 提示关节损伤程度与MMP-I的表达成正相关,徐长卿丹皮酚可能具有抑制MMP-1的表达,消除MMP-1对软骨细胞外基质过度降解的作用.与此同时,MMP-1的特异性抑制物TIMP-1虽然随着MMP-1分泌的升高也有所升高,但与MMP-1的升高不同步,两者的分泌水平相差较大,可能使MMP-1对关节软骨的降解作用过度发挥.关节损伤程度与TIMP-1的表达成负相关,徐长卿丹皮酚可能具有促进TIMP-1的表达,从而达到抑制MMP-1表达的作用.徐长卿丹皮酚对骨性关节炎的治疗作用是通过抑制损伤软骨中MMP-1mRNA的表达和促进TIMP-ImRNA的表达这一双向调节机制来实现的.