犬蝠源呼肠病毒的分离与鉴定

摘要

从广东省韶关采集了30份野生犬蝠样品,研磨后接种Vero-E6细胞,从中分离到2株病毒.其中一株在Vero-E6细胞上盲传至第4代开始出现细胞病变,表现为细胞内颗粒增多,细胞收缩、变圆,最后细胞从瓶壁脱落;反复冻融3次后,收集细胞及培养液,电镜观察发现,病毒粒子无囊膜,有双层衣壳,呈正二十面体对称,具有呼肠病毒科(Reoviridae)成员的形态特征,将病毒命名为Bat/China/2003(B/03);红细胞凝集试验表明该病毒能凝集健康人O型血红细胞,不能凝集SPF鸡、实验用普通级牛、大鼠和豚鼠的红细胞,这与哺乳动物呼肠病毒血清1型的血凝谱相近;病毒基因组经琼脂糖凝胶电泳分大、中、小3个区段.以上结果均符合已报道的呼肠病毒的生物学特征.为了进一步的从分子水平上确定该病毒是呼肠病毒科成员,用哺乳动物呼肠病毒特异性引物进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR),扩增得到了预期大小的片段.测序结果经NCBI BLAST分析表明,与呼肠病毒科正呼肠病毒属的Ndelle virus核苷酸同源性最高为91.2％.用DNAMAN Multiple Alignment进行序列同源性分析,与哺乳动物呼肠病毒血清1、2、3型的代表株T1L,T2J,T3D的核苷酸同源性分别为89.9％、76.9％、89.9％;从同源性上来看,该片段与人、鼠和牛的呼肠病毒同源性较高(核苷酸同源性76.9～91.2 ％,氨基酸同源性95.4％～100％),与水生呼肠病毒同源性较低(核苷酸同源性47.4～50.9 ％,氨基酸同源性51.7％).基因分析结果从分子水平上进一步证明了新分离的这株病毒是呼肠病毒科成员.