检测戊型肝炎病毒核酸的实时荧光聚合酶链反应法的建立

摘要

目的：建立一种能快速、敏感地检测戊型肝炎病毒(HEV)核酸的实时荧光聚合酶链反应法(Real time RT-PCR)。方法 基于HEV ORF3保守区序列,设计26条引物和3条探针,并从中进行筛选,而且对选择出的引物和探针的浓度以及反应体系、反应条件和核酸的抽提方法等进行优化和选择。结果 从26条引物和3条探针中优化出一对引物和探针的组合,优化的30μL反应体系含有10mmol/LTris-HCI(pH9.2),50mmol/LKCl,1.0mmol/LMgCl<,2>,0.175mmol/LdNTPs,上游引物为0.10mmol/L,下游引物为0.10mmol/L,探针为0.20mmol/L,Taq酶的浓度为3U,AMV逆转录酶2U;优化的反应条件为50℃ 30min;95℃ 3min;95℃ 10sec 50℃ 30sec 72℃ 60sec,5个循环,95℃ 10sec 57℃ 40sec,40个循环。初步结果显示具有较好的特异性和敏感性。结论 建立的检测HEV核酸的实时荧光聚合酶链反应法具有简便、快速、灵敏度较高以及不易被污染等优点,具有一定的临床应用潜力。