小麦赤霉菌β-微管蛋白的原核表达及其分离纯化

摘要

小麦赤霉病(Wheat Scab)是中国长江中下游冬麦区和东北春麦区发生的重要病害。其病原菌的无性态为禾谷镰孢菌(Fusarium graminearumSchw),有性态为玉蜀黍赤霉[Gib-berella zeae(Schew.),Retch]。自1991年报道发现抗性菌株以来,连续多年的监测结果表明抗性菌株比例呈上升趋势。近年来对许多病原真菌的抗性检测发现B.微管蛋白基因的点突变,导致蛋白的三维构象发生改变,能阻止药剂与靶标结合,导致抗药性的产生,但周明国等人的研究发现,从禾谷镰孢菌(Gibberella zeae)对多菌灵(MBC)的敏感菌株(MBC s)和田间及室内诱导抗药性菌株(MBC R)中扩增β一微管蛋白基因,经核苷酸序列分析表明,MBC R菌株未发生任何位点的突变,说明G.zecte对MBC的抗药性机制并非像其他丝状真菌一样由β-微管蛋白198位氨基酸突变所致。而是与一种未命名微管蛋白有关,该基因与其他常见真菌尽微管蛋白基因氨基酸序列同源性70%～78%。本研究旨在将该病原菌β-微管蛋白原核表达,分离和纯化,为进行离体药剂与靶标蛋白结合试验,制备靶标蛋白的单克隆抗体奠定基础。本研究扩增了禾谷镰孢菌(G.zeae)对多菌灵(MBC)敏感菌株(MBC s)的β-微管蛋白基因(β1-tub)和MBC s的未命名微管蛋白基因(β2-S),及中抗菌株(MBC MB)的未命名微管蛋白基因(β2-MR)和高抗菌株(MBC HR)的未命名微管蛋白基因(β2-HR),并将其连接到了原核表达载体pET32a上,转化至大肠杆菌Rosetta-gami,经IPTG(1mM)诱导4h后,得到了N末端融合了6×His纯化标签的表达产物,用HisTrap TM HP Columns进行纯化,纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳进行纯度分析。结果显示,诱导后的在大肠杆菌中表达了分子量约68kD左右的蛋白,和预测的目标蛋白大小一致,表达的产物主要以包涵体的形式存在,表达量依次占细菌总蛋白量的88.7%、75.2%、41.8%和77.3%。纯化后显示,各蛋白的纯度均达到90%以上。原核细胞表达系统具有成本低、周期短、操作简便等许多优点,本试验构建了表达β微管蛋白和未命名的微管蛋白的高效表达质粒,为下一步实验需求打下了基础。