以GPT和GFP为双重筛选标记的禽痘病毒通用转移载体的构建及鉴定

摘要

禽痘病毒作为活载体已经得到广泛的应用，转移栽体的构建是重组禽痘病毒构建的重要环节。本研究构建了禽痘病毒通用转移载体pSY681-gfp-gpt，该载体含有gfp和gpt两个报告基因及背对的痘苗病毒晚期启动子P11和早期启动子P7.5，P11启动gfp和gpt两个基因，P7.5用于启动外源基因，在早期启动子P7.5下游引入NotⅠ和AflⅡ两个酶切位点，用于外源基因的插入。为检测禽痘病毒通用转移载体pSY681-gfp-gpt的效果，将H9亚型禽流感病毒A/Chicken/Shanghai/10/01(H9N2)的HA基因插入到此载体构建了转移载体pSY681-gfp-gpt-HA，应用TransIT(R)-LT1 Transfection Reagent将此转移载体转染已感染禽痘病毒S-FPV-017的鸡胚成纤维细胞，利用gfp和gpt同时进行双重筛选、数轮蚀斑纯化构建了重组病毒rFPV-gpt-gfp-HA9，通过PCR、Western blot鉴定，结果证明，获得了能稳定表达AIVHA蛋白的重组禽痘病毒r-FPV-gpt-gfp-HA9。