重组质粒表达的IBDV vp2基因特异miRNA对IBDV复制的抑制作用

摘要

用Genscript软件分析IBDV结构蛋白vp2基因序列，预测得5个潜在的miRNA，将其插入表达载体pRFPRNAiC。将重组载体与报告载体pVP2-GFP共转染DF-1细胞，经Northern dot blotting检测确认miRNA获得表达。对转染细胞进行荧光共聚焦显微镜观察和流式细胞术定量分析，结果显示融合报告基因表达抑制效率在59.7%～78.5%之间。分别将抑制效率较高的miVP2A和miVP2E克隆入含neo基因的pTarget载体，用获得的重组质粒转染DF-1细胞，经G418筛选后用IBDV Lurket株感染，用半定量RT-PCR检测vp2基因转录子，用病毒滴定法测定细胞培养上清中的病毒TCID50。结果显示，针对vp2基因的miVP2A和miVP2E均能有效抑制IBDV基因表达和病毒复制，可使IBDV感染细胞上清中的TCID50分别下降5和6lgs，为进一步用RNAi抑制IBDV复制研究奠定了基础。