CpG DNA重组质粒作为疫苗佐剂的生物安全性评价

摘要

CpG motif是一些以非甲基化的胞嘧啶、鸟嘌呤二核苷酸(CpG)为模体的寡聚脱氧核苷酸(oligo-deoxynucleotides，ODN)的免疫刺激序列，是经研究证实的一种新型疫苗佐剂。为克服人工合成的CpG ODN容易降解、成本高的缺陷，将其克隆到质粒载体上以便于规模化发酵培养和生产，改进和提高疫苗免疫效果，但以其重组质粒(CpG DNA)作为佐剂接种动物机体后，能否产生转基因生物安全隐患，需对其在动物体内的组织分布、基因组整合以及排出体外后对环境微生物的影响进行系统评价。rn 本研究自2005年开始按照农业部对转基因生物安全评价的有关规定以及中间试验、环境释放试验和生产性试验批复的具体要求，对CpG DNA重组质粒作为口蹄疫灭活疫苗的免疫佐剂的安全性问题进行了系统研究和评价。rn 各阶段试验证实：CpG DNA重组质粒大剂量接种免疫实验动物小鼠(1000μg/只，常规剂量的10倍)和靶动物猪(1000μg/头，常规剂量的5倍)后，没有出现可见的毒副作用。在CpG DNA重组质粒接种试验猪24h后，其主要存在于接种部位的肌肉组织中;接种后3～10d，重组质粒随血液循环进入并主要分布在脾脏、肺脏、肾脏等多种器官组织中;在接种后15d，实验猪的所有组织中均已检测不到重组质粒，说明重组质粒已全部代谢或排出体外。在CpG DNA重组质粒接种猪的各组织细胞的基因组DNA中均未PCR扩增出CpG基序序列，表明CpG DNA重组质粒整合到动物机体基因组上的可能性极小。CpG DNA重组质粒接种靶动物后，其分泌物和排泄物中也未检测到重组质粒的存在，说明质粒进入体内后经过一段时间后大部分会被代谢降解，不会以原型的重组质粒DNA排泄到体外。在接种动物环境样品中，所有样品没有检测到CpG DNA重组质粒所携带的CpG和Lac启动子基因序列，但部分样品扩增到了Amp抗性基因，但与环境微生物所携带Amp抗性基因序列的同源性较高，阳性样品率与对照样品相似，说明接种动物环境现场采集样品扩增出的抗性基因可能与动物接种重组质粒没有直接关系，不会转化环境微生物而影响其遗传特性。rn 结论：CpG DNA重组质粒作为猪口蹄疫灭活疫苗的佐剂，不会对动物和环境造成潜在危害，具有较高的转基因生物安全性。