聚球藻7942生物钟基因KaiB的克隆与敲除载体的构建

摘要

蓝藻的生物钟基因(Kai基因)簇包括3种基因:KoiA, KaiB和KaiC，它们组成了生物钟的中央振荡器部分。本文克隆KaiB基因是为了用反向遗传学研究其功能。基因克隆从设计和合成相应的引物开始。接着提取聚球藻7942的基因组DNA作为模板；用PCR扩增KaiB；与质粒PUC19相连，转化大肠杆菌DHSa,请公司测序；把测得结果经NCBI用Blast比对，证明与GenBank中聚球藻7942的同源性为100%。这说明，正确地克隆了KaiB，这个基因含309个碱基。把克隆到得KaiB基因与T载体相连;然后用BamH I和Sal I双酶切克隆载体pMD-KaiB和穿梭表达载体pRL-489载体大片段；用T4DNA连接酶连接这两个片段；转化大肠杆菌DHSa，涂板后用卡那霉素筛选阳性克隆：从大肠杆菌转化子中提取PRL489-KaiB载体，做酶切和电泳，鉴定KaiB基因的插入，证明敲除载体批pRL489-KaiB已构建好。