小鼠附睾分泌蛋白Fam12b的原核表达纯化

摘要

本研究旨在克隆小鼠附睾分泌蛋白Faml2b，构建pET28(a)-fam12b-fam12b原核表达重组质粒，从大肠杆菌Rosetta (DE3)中获得纯化的His-Fam12b-Fam12b融合蛋白。应用RT-PCR方法从8周龄小鼠附睾中扩增出两段不含信号肽的fam12编码序列，其中一个不含终止密码子，另一个含有终止密码子，将这两个序列串联克隆到原核表达载体pET28(a)中，经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化火肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞，IPTG诱导表达，Ni-NTA纯化融合蛋白His-Fam12b-Fam12b并经SDS-PAGE和Western印记分析鉴定。获得小鼠附睾分泌蛋白基因fam12b的序列，测序结果与己发表的基因序列一致。纯化后的His-Fam12b-Faml2b融合蛋白经过SDS-PAGE和Western印记分析鉴定，在相对分子质量31kD处有特异的蛋白条带，纯化后获得高纯度融合蛋白。本研究成功克隆了小鼠附睾基冈fam12b，并在Rosetta(DE3)中高效表达，亲和层析后获得高纯度融合蛋白。为制备其多克隆抗体奠定了基础，为进一步研究Fam12b的功能创造了条件。