肿瘤坏死因子-α诱导胃腺癌细胞凋亡中热休克蛋白作用的研究

摘要

目的:探讨热休克蛋白在肿瘤坏死因子-a(TNF-a)诱导胃腺癌BGC823细胞凋亡中的作用，为进一步探讨HSP抗凋亡机制及胃癌生物治疗提供实验依据。rn 方法:细胞培养将胃腺癌BGC823细胞培养于RPMI 1640培养液中，加入10%灭活胎牛血清，8万U庆大霉素，37℃、5% C02培养箱内培养。3天换液一次，5～7天传代一次，传代时用0.25%胰蛋白酶及0.02% EDTA混合液消化。将细胞以1×105／ml密度接种于24孔培养板中，每孔放置小盖片，爬片生长24小时。实验分组：将培养细胞分为热休克组(HS)和非热休克组(NHS)，每组分为HS+ TNF-Q、NHS+ TNF-Q，TNF-Q浓度分别为O ng/ml（对照），25 ng/ml，50 ng/ml和100 ng /ml (AO—A3)，作用4小时。热休克组细胞42℃热休克处理l小时，再37℃恢复2小时。DNA片段原位末端标记检测(TUNE1)参照宝灵曼公司试剂盒说明书操作。以不加TdT酶溶液的反应溶液作为实验本底对照，用高三尖杉酯碱（HHT）作用后的细胞作为阳性对照。光镜下观察，经DNA片段原位末端标记后，细胞内有淡黄色至棕黄色的颗粒为凋亡细胞。计数1000个细胞中凋亡细胞的数量为凋亡细胞(AI)。3H_TdR掺入试验：直接检测DNA合成状态，掺入的3H_TdR量越多，细胞合成的DNA就越多，检测所掺入的3H_TdR就可以反映细胞增殖的程度。细胞培养终止前3小时，加入10μ1 3H-TdR，用0.25%胰蛋白酶与0.02% EDTA混合液消化细胞，每孔加消化液50μl，用细胞收集器将细胞吸咐在玻璃纤维滤纸上。滴加5%三氯醋酸1-2ml以固定细胞，无水乙醇以脱水、脱色。将滤纸烘干过夜后，放入盛有5 ml闪烁液的测量杯中，放置20分钟后放入p-闪烁仪测定cpm值(countsper minute)，cpm值表示3H_TdR掺入量。rn 结果:HSP对胃腺癌BGC823细胞凋亡的作用：非热休克组(NHS)凋亡指数依TNF-α浓度(A1～A3)不同分别为7.65±1.12、19. 24±1.71和23. 25±3.22比对照组(AO)1.01±0.29明显增高(P<0.Ol)：热休克组(HS)凋亡指数在同浓度TNF-α(A1～A3)诱导下分别为3.16±1. 46、5.36±2.55和12. 49±4.36比对照组(AO)2. 56±1.15增高(P<0.01)。而热休克组与非热休克组组间两两相比较凋亡指数均下降(P<0.01)。表明HSP对胃腺癌BGC823细胞具有明显抑制作用，且这种作用与TNF-α呈明显剂量依赖关系。HSP对胃腺癌BGC823细胞DNA合成的影响：非热休克组( NHS) cpm值与对照组(AO)3664. 24±376. 23相比，随着TNF-α浓度增加，呈现下降(P<0.01)，抑制率增加；三种浓度(AI～A3) TNF-a组cpm值分别为1453. 45±98. 32、1284. 15±59. 79和1011. 88±76. 39;而热休克组(HS) cpm值与对照组(AO) 7221. 63±489. 54也呈现下降(P<0.01)，抑制率增加：三组(A1～A3) cpm值分别是5655. 58±185. 32、4568. 56±198. 77和3644. 25±213. 57。热休克组与非热休克组cpm值组间两两相比，HS组比NHS组cpm值上升，表明HSP对由TNF-α抑制胃腺癌BGC823细胞的DNA合成具有拮抗作用，这种作用也呈现明显依赖效应。rn 结论:热休克反应对胃腺癌BGC823细胞经TNF-α诱导凋亡具有抑制作用，此作用与TNF-α呈剂量依赖效应。