宽宿主温敏质粒pBBR1MCS-2M的研究

摘要

宽宿主质粒pBBR1MCS-2是应用性很广的载体,该质粒含有2个重要的元件:rep基因和mob基因.其中rep基因编码REP蛋白,参与质粒的复制;mob基因编码移动基因,参与质粒的接合和转移.质粒pBBR1MCS-2同样含有一个卡那霉素(kan)抗性筛选标记,同时它的大小仅有5145bp.这些特性使该质粒适用于DNA克隆、蛋白表达,广泛用于革兰氏阴性菌的分子操作.虽然pBBR1MCS-2已经实现商业化,但目前却未见温度敏感的改造和应用的报道.开发温度敏感型质粒载体可以扩大pBBR1MCS-2质粒的应用范围.温度敏感型质粒载体可以方便的控制质粒在宿主中的存在.当温度比较低时,质粒可以存在宿主中,表达想要的性状,而当温度提高后,温度敏感型质粒载体将因无法复制而丢失或整合到染色体上.本研究利用易错PCR将pBBR1MCS-2质粒上的rep基因及其启动子、终止子进行了随机突变,再通过温度变化筛选获得1个突变的质粒载体.该在大肠杆菌Escherichia coli T1、DH5α、BW25113、S17-1以及类球红细菌Rhodobacter sphaeroides中表现出温度敏感性状.对测序表明,rep基因的-43位置发生了一个T-A的突变,73和436位置各发生了一个A-G突变,导致REP蛋白发生了K24G、I145V的突变.进一步的单点突变实验表明,是K24G的突变,使得该质粒变成温度敏感型质粒.在pYB1s质粒中分别表达突变前后的REP蛋白,圆二色谱表明突变蛋白二级结构发生了明显的变化,其Tm值降低了4.9℃.