肺癌特异性DKK1基因转录调控元件的分析预测及活性筛选

摘要

Dickkopf1(DKK1)是经典wnt信号通路的拮抗剂,它可以与Lrp5/6受体蛋白结合,对wnt信号通路产生竞争性抑制作用.此外,DKK1在多种非小细胞细胞系、组织中均具有特异性、高水平表达的特点,可作为一种肺癌诊断的血清标志物.之前的研究发现DKK1启动子在肺癌中的活性并不是很高,因此本文认为仍可能存在其他转录调控元件(Transcriptional regulatory elements,TREs)增强子协同调控启动子活性.鉴于目前涉及DKK1增强子等调控元件的研究较少,主要集中在DKK1启动子片段上,筛选鉴定DKK1增强子片段可用于进一步的DKK1调控机制研究.rn 参与基因转录调控的这些转录调控元件主要包括启动子、增强子、绝缘子等,与启动子元件一般位于调控基因的5,端不同,增强子等调控元件在散布在基因组中,位置并不固定.本研究的关键难点在于对DKK1基因增强子等转录调控元件在基因组中预测及定位.研究通过UCSC人类基因组浏览器获取A549细胞中DKK1基因位点的DNaseⅠ超敏性、组蛋白修饰等表观遗传信息,对这些信息进行分析,得到12条候选增强子元件序列,用于下一步高活性增强子片段筛选.rn 鉴于DKK1启动子全长片段较大,因此需要筛选一段具有较高活性且片段较小的近端启动子片段.首先本文先将四段不同长度的DKK1启动子片段构建到pGL3-basic载体中,选择其中一段作为DKK1基因近端启动子片段.将构建得到的重组载体转染A549、H460、H446、Eca-109、Chang liver和HEK293细胞,并通过双荧光素酶报告基因系统检测不同长度DKK1启动子片段活性,最终确定DKK1-5片段活性较好,可作为DKK1基因近端启动子片段.rn 最后将这12条候选片段分别插入到DKK1-5近端启动子上游,成功构建重组质粒,并通过双荧光素酶报告基因检测系统检验相关候选元件的增强子活性.本文在细胞水平得到六段候选元件:在A549细胞中TRE3、TRE4、TRE6、TRE7、TRE8、TRE12对DKK1启动子具有显著增强作用.TRE3、TR4、TRE12在H460中具有显著增强作用.而且TRE3、TRE4、TRE7、TRE8对DKK1启动子的增强作用具有非小细胞肺癌特异性.