Ensayo para la evaluación del transporte endosomal

摘要

Un ensayo para evaluar la capacidad de liberación de endosomas de una molécula de ensayo, en donde dicha molécula de ensayo es una neurotoxina clostridial o una proteasa no citotóxica re-dirigida (inhibidor de secreción dirigido) en donde la capacidad de unión natural de la proteasa no citotóxica ha sido modificada por la introducción de un ligando de unión o de una estructura diana, y en donde dicha molécula de ensayo tiene la capacidad de segmentar proteolíticamente e inactivar una proteína SNARE; comprendiendo dicho ensayo: i) poner en contacto una célula eucariota con una molécula de ensayo que se ha de evaluar en relación con la capacidad de liberación de endosomas, en donde dicha célula eucariota comprende una membrana celular que incluye un sitio de unión presente en la superficie externa de la membrana celular de dicha célula; ii) incubar la molécula de ensayo con dicha célula eucariota, y permitir de esta forma: a) que la molécula de ensayo se una y forme un complejo unido con el sitio de unión presente en la célula eucariota, permitiendo así que dicho complejo unido se introduzca en la célula eucariota mediante endocitosis; b) que se formen uno o más endosomas dentro de dicha célula, en donde el uno o más endosomas contienen la molécula de ensayo; y c) que dicha molécula de ensayo entre en el citosol de la célula eucariota cruzando la membrana endosomal del uno o más endosomas; iii) eliminar el exceso de molécula de ensayo que no está unido a los sitios de unión presentes en las células eucariotas; iv) después de un período de tiempo predeterminado, detectar la cantidad de molécula de ensayo presente en el uno o más endosomas, o detectar la cantidad de molécula de ensayo presente en el citosol de dicha célula eucariota; v) comparar la cantidad de molécula de ensayo detectada en la etapa iv) con un valor testigo, en donde dicho valor testigo representa la cantidad de molécula de ensayo presente en el uno o más endosomas o la cantidad de molécula de ensayo presente en el citosol antes de la etapa iv); vi) calcular un valor de liberación de endosomas para la molécula de ensayo determinando el cambio relativo de la cantidad de molécula de ensayo que está presente dentro del uno o más endosomas o determinando el cambio relativo de la cantidad de molécula de ensayo presente en el citosol de dicha célula eucariota. en donde dicha etapa (iv) comprende detectar la molécula de ensayo usando un marcador fluorescente.