一种季铵化多齿配体修饰的量子点及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种季铵化多齿聚合物所修饰量子点的制备方法及其生物应用。以上聚合物具有两亲性嵌段结构，包含疏水嵌段与亲水嵌段。其中，疏水嵌段包含巯基以及季铵基团，亲水嵌段含有羧基。基于以上季胺化多齿配体，可对小分子单齿配体稳定的量子点进行表面修饰。经季胺化多齿聚合物修饰的量子点具有优异的光稳定性。此外，聚合物配体中的季铵盐可以使量子点表面带正电，对细菌生物膜具有良好的渗透作用和成像能力。综上，本发明提供了一种季铵化多齿聚合物配体表面修饰量子点的制备方法，增强了量子点稳定性，为生物膜研究提供了新型的荧光探针。

说明书

技术领域

本发明属于量子点表面修饰技术领域，具体涉及一种季铵化多齿配体修饰量子点的制备方法与应用。

背景技术

量子点具有吸收峰宽、发射峰窄、斯托克斯位移大、发射波长可调、抗光漂白、荧光量子效率高等优异的光学特性。目前，量子点已被作为高性能荧光探针广泛应用于细胞标记、生物检测、生物成像等生物医学领域。为满足生物医学应用的需要，量子点通常需要进行表面修饰。目前，针对于有机相量子点已发展了多种表面修饰方法，包括二氧化硅包覆、两亲性聚合物包覆、配体交换等。二氧化硅包覆可以提高量子点的生物相容性和稳定性，但是该方法需要较为苛刻的反应条件，严重影响量子点荧光性能，而且其制备过程的可控性较差。两亲性聚合物包覆的方法相对较为简单，可通过聚合物中疏水部分与量子点表面间非共价相互作用，赋予其胶体稳定性。但是，所得量子点流体力学尺寸较大，而且范德华作用力较弱，容易解离，稳定性不足。配体交换策略使用亲水性配体换掉量子点表面的疏水性配体，赋予量子点水分散性，所得量子点流体力学尺寸较小。但是该方法通常使用的小分子配体容易从量子点表面解离，稳定性不足。尽管水相量子点具有水分散性，但采用的巯基小分子单齿配体存在与量子点结合位点较少且结合力较弱的问题，易于发生光化学氧化并从量子点表面脱落，从而导致量子点聚集并失去光学性能。因此，当前仍然需要发展新的量子点表面修饰策略，使其具有良好稳定性并保持优异的荧光性能。

细菌生物膜的形成与许多持续性感染和医疗器械相关感染有密切关系。细菌在形成生物膜过程中产生大量胞外聚合物(EPS)，使得细菌对抗生素产生高耐药性。量子点具有高亮度荧光信号，可以作为新型荧光探针用于生物膜结构与性质的研究。此前的研究发现，量子点表面性质对其在细菌生物膜中的渗透有显著影响。由于细菌生物膜组分通常带有负电，表面带有负电的量子点与其存在斥力作用，难以有效渗入生物膜；而表面带正电的量子点与生物膜存在引力，对细菌生物膜的渗透显著增强。此外，相比于完全亲水性的量子点，具有一定疏水性的量子点可与生物膜疏水部分作用，能够较为均匀地分布在生物膜内。因此，同时具有正电荷和疏水基团的量子点会对细菌生物膜有更好的渗透与标记能力。

发明内容

针对上述背景及存在的问题，本发明提出了一种季铵化多齿配体修饰的量子点及其制备方法与应用，旨在解决现有量子点表面修饰技术中的不足。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种季铵化多齿配体修饰的量子点，所述量子点是由碲化镉/硫化镉核壳量子点CdTe/CdS QD经含季铵盐两亲性多齿巯基聚合物PAVDA修饰而成，所述碲化镉/硫化镉核壳量子点直径为5～10nm。

进一步的，所述含季铵盐两亲性多齿巯基聚合物PAVDA包括疏水嵌段与亲水嵌段，疏水嵌段包含巯基，亲水嵌段包含羧基。

一种季铵化多齿配体修饰量子点的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备含季铵盐的两亲性的多齿巯基聚合物PAVDA；

1.1)以偶氮二异丁腈为引发剂，以丙烯酸叔丁酯、乙烯基苄氯为原料；加入2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸为RAFT试剂，其中，偶氮二异丁腈，丙烯酸叔丁酯，乙烯基苄氯和2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸用量的摩尔比为1∶5～10∶50～100∶30～200，在70℃下反应24h，得到含有苄氯的嵌段聚合物前体；

1.2)将步骤1.1)所得含有苄氯的嵌段聚合物前体溶于四氢呋喃中，加入硫代乙酸钾，其中，含有苄氯的嵌段聚合物前体和硫代乙酸钾用量的摩尔比为1∶20～30；搅拌超声至完全溶解，氮气保护，室温反应24h；得到含有硫代乙酸酯的嵌段聚合物；

1.3)将步骤1.2)所得含有硫代乙酸酯的嵌段聚合物溶于DMF中，加入正丁胺和二硫苏糖醇，其中，含有硫代乙酸酯的嵌段聚合物，正丁胺和二硫苏糖醇用量的摩尔比为1∶200～300∶100～300；冻融循环三次，氩气保护，60℃下避光反应24h；用1mol/L的盐酸调节溶液pH值为1，得到含巯基的嵌段聚合物；

1.4)将步骤1.3)所得含巯基的嵌段聚合物溶于二氯甲烷中，再加入三氟乙酸，其中，含巯基的嵌段聚合物和三氟乙酸用量的摩尔比为1∶100～300；冻融循环三次，氩气保护，室温避光反应24h；得到两亲性的多齿巯基聚合物P(AA-b-VBT-VBC)；

1.5)将步骤1.4)中所得P(AA-b-VBT-VBC)，加入十八烷基二甲基叔胺进行季铵化，其中，P(AA-b-VBT-VBC)和十八烷基二甲基叔胺的摩尔比为1∶1～10，四氢呋喃作为溶剂，搅拌溶解，60℃下反应12h，得到PAVDA；

(2)制备碲化镉/硫化镉核壳量子点CdTe/CdS QD；

2.1)制备Te源；

将Te粉和NaBH

2.2)制备Cd源；

将CdCl

2.3)制备碲化镉量子点CdTe QD；

将步骤2.1)所得的NaHTe溶液加入到步骤2.2)所得的混合溶液中，其中，NaHTe溶液和MPA的体积比为1∶0.19，130℃油浴加热反应，当量子点的吸收峰在475～485nm之间时，停止加热；将以上量子点溶液旋蒸浓缩，过滤，进行离心纯化，将沉淀分散于超纯水中，制备得到浓度为312.9μM的CdTe QD溶液；

2.4)制备碲化镉/硫化镉核壳量子点CdTe/CdS QD；

将CdCl

(3)制备季铵化多齿配体修饰的碲化镉/硫化镉核壳量子点PAVDA-QD；

依次加入步骤(1)所得PAVDA、步骤(2)所得CdTe/CdS QD水溶液、NaOH溶液、水及N’N-二甲基甲酰胺，通过微波加热的方式对量子点进行表面修饰，完成PAVDA-QD的制备。

进一步的，所述步骤2.4)中微波加热反应条件为110℃、10min。

进一步的，所述步骤(3)中微波加热反应条件为100℃、10min。

进一步的，所述步骤(3)中CdTe/CdS QD水溶液浓度为1μM，PAVDA中巯基与CdTe/CdS QD的摩尔比为50～1000∶1，NaOH与巯基的摩尔比为1～15∶1，水与N’N-二甲基甲酰胺的体积比为1～12∶1。

进一步的，步骤2.4)所述加入CdTe QD母液的体积为：

其中，C

进一步的，步骤2.3)和2.4)所述离心纯化步骤是指在量子点溶液中加入异丙醇，至出现微微浑浊，在12000rpm下离心10min，保留上清液，弃去沉淀；在所得上清液中继续加入异丙醇至完全浑浊，12000rpm下离心10min，弃去上清液，得到纯化后的产物。

一种季铵化多齿配体修饰量子点的应用，所述PAVDA-QD能够有效地对细菌生物膜进行渗透，并均匀地积累在细菌生物膜中。

进一步的，所述细菌生物膜为金黄色葡萄糖球菌生物膜时，所述PAVDA-CdTe/CdSQD的作用浓度为200μg/mL；所述细菌生物膜为铜绿假单胞菌生物膜时，所述PAVDA-CdTe/CdS QD的作用浓度为200μg/mL。

有益效果：

(1)本发明中聚合物配体含有多个巯基，能够通过多齿协同作用等方式增强配体与量子点之间的结合力。

(2)本发明中聚合物配体中的季铵盐片段，能够直接与量子点表面通过静电作用的方式，进一步增强其与量子点之间的结合力。

(3)PAVDA-QD具有优异的光稳定性。一方面，聚合物配体中的多齿巯基能够修复量子点表面的硫空位，从而减少量子点表面的缺陷，降低光氧化对量子点的影响；另一方面，聚合物中的季铵盐基团能够与量子点表面通过静电作用，增强配体与量子点之间的结合力，从而增强量子点的稳定性。

(4)对细菌生物膜具有渗透作用，并能够均匀地分布在细菌生物膜中。首先，本发明所制备的PAVDA-QD带正电，能够对细菌生物膜进行渗透。其次，本发明中所制备的聚合物配体含有疏水烷基链，使得PAVDA-QD能够均匀地分布在细菌生物膜中。

附图说明

图1是本发明实施例1验证PAVDA配体成功制备的核磁共振氢谱图；

图2是本发明实施例1验证PAVDA-QD带正电的结果示意图；

图3是本发明实施例2验证PAVDA-QD光稳定性，分别在紫外光照射0min、20min、40min、60min、80min、100min、120min的照片；

图4A、4B和4C分别是是本发明实施例2验证MPA-QD、PAVDA-QD光稳定性在紫外光照射下的荧光强度变化及归一化荧光强度变化；

图5和图6是本发明实施例3通过共聚焦显微镜成像技术验证PAVDA-QD对细菌生物膜的渗透作用。

具体实施方式

为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图1-6和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述，但本发明的保护范围并不局限于此。

实施例1：含季铵盐多齿配体所修饰量子点(PAVDA-QD)的制备

(1)PAVDA聚合物配体的制备

1.1)称量引发剂偶氮二异丁腈8.44mg(0.051mmol)，丙烯酸叔丁酯560mg(0.257mmol)和乙烯基苄氯784.4mg(5.14mmol)依次加入25mL史兰克反应管内，加入4mL四氢呋喃使其完全溶解，反应管用橡胶塞和parafilm封口膜密封，冻融循环三次。加入546.7mg(1.5mmol)2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸链转移试剂，70℃油浴加热反应24h。旋蒸浓缩，用甲醇沉降三次，按照沉降剂与产物体积比为20:1的比例进行沉降。60℃下真空干燥24h，完成含苄氯嵌段聚合物前体的制备；

1.2)将含有苄氯的嵌段聚合物前体1000mg(0.176mmol)溶于5mL四氢呋喃中，加入硫代乙酸钾436mg(3.81mmol)，搅拌超声至完全溶解，氮气保护，室温反应24h。用水沉降三次，按照沉降剂与产物体积比为20:1的比例进行沉降。60℃下真空干燥24h，得到含有硫代乙酸酯的嵌段聚合物。

1.3)将含有硫代乙酸酯的嵌段聚合物300mg(0.046mmol)溶于4mL DMF中，加入正丁胺618mg(8.45mmol)，再加入二硫苏糖醇651.5mg(4.22mmol)，冻融循环三次，氩气保护。60℃油浴避光反应24h，用1mol/L的盐酸调节溶液pH值为1。旋蒸浓缩，甲醇沉降一次，按照沉降剂与产物体积比为20:1的比例进行沉降。25℃下真空干燥24h，得到含巯基的嵌段聚合物；

1.4)将含巯基的嵌段聚合物100mg(0.013mmol)溶于2mL二氯甲烷中，再加入三氟乙酸238.3mg(2.09mmol)，冻融循环三次，氩气保护。室温避光反应24h。正己烷沉降三次，按照沉降剂与产物体积比为20:1的比例进行沉降。25℃下真空干燥24h，完成两亲性多齿巯基嵌段聚合物P(AA-b-VBT/VBC)的制备。

1.5)称量700mg(2.32mmol)P(AA-b-VBT/VBC)置于50mL史兰克反应管中，加入十八烷基二甲基叔胺3452mg(11.6mmol)，加入15mL四氢呋喃，60℃油浴加热反应12h。反应结束后，加入30ml二氯甲烷进行稀释，旋蒸浓缩至5ml左右，选用正己烷作为沉降剂，按照沉降剂与产物体积比为20:1的比例进行沉降。沉降结束后，进行抽滤，保留产物，去掉副产物，将产物溶解在30ml二氯甲烷中，重复以上步骤三次，60℃真空干燥24h，得到含季胺盐的聚合物PAVDA，对聚合物PAVDA进行核磁表征(见图1)。

(2)CdTe/CdS QD的制备

2.1)Te源的制备

称量95.7mg(0.76mmol)Te粉和73mg(1.93mmol)NaBH

2.2)Cd源的制备

称量229mg CdCl

2.3)CdTe QD的制备

向步骤2.2)N

2.4)CdTe/CdS QD的制备

称量580mg CdCl

(3)季铵化多齿聚合物所修饰CdTe/CdS QD的制备

按比例依次加入量子点溶液、聚合物溶液、NaOH溶液、水及DMF，其中，聚合物中巯基与量子点的摩尔比为250：1，NaOH与巯基的摩尔比为9:1，水与DMF的体积比为9:1，通过微波加热的方式对量子点进行表面修饰，反应条件为100℃、10min，其中CdTe/CdS QD的终浓度为1μM，反应后通过超滤对产物进行纯化，得到季胺化多齿聚合物配体修饰的CdTe/CdSQD，即PAVDA-QD，对PAVDA-QD进行Zeta电位测试(见图2)。

实施例2：PAVDA-QD的光稳定性

将MPA-QD、PAVDA-QD量子点的浓度稀释至1μM，用三台紫外灯从左、右、上三个方向照射修饰后的量子点溶液，每隔20min测试量子点的荧光发射光谱。由图3和4可见，在紫外光照射MPA-QD 120min后，MPA-QD发生聚集，出现沉淀，量子点的荧光强度只有原始的19％。相比于MPA-QD，PAVDA-QD的荧光强度下降缓慢，照射至120min后，仍然未发生沉淀，荧光强度能够保留原始的63％。该实验结果表明PAVDA-QD具有优异的光稳定性。

实施例3：PAVDA-QD对生物膜的渗透作用

1.金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌生物膜的培养

金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌均在20％甘油溶液中保存于-80℃冰箱中，使用前，用无菌枪头挑取少许冷冻液，在LB培养基平板上划线，37℃恒温培养18h。将5mL LB液体培养基置于50mL离心管中，挑取一金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的单菌落，在LB液体培养基中吹打5次。在37℃、200rpm条件下恒温过夜培养12h，得到金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌过夜培养菌悬液。将新鲜的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌菌悬液用1％葡萄糖的LB液体培养基分别稀释至1×10

2.共聚焦显微镜荧光成像

首先，除去细菌生物膜的上层培养基，用无菌生理盐水洗去游离细菌。在金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌生物膜上分别加入1mL体积含有200μg/mL MPA-QD、PAVDA-QD的生理盐水分散液。在37℃恒温培养箱中避光孵育12h，除去上层的分散液。加入50μL Hoechst染色液，室温条件下避光染色20min，使用共聚焦荧光显微镜进行3D扫描成像，激发波长为405nm，发射波长范围为450-500nm(Hoechst)和550-650nm(QDs)。实验结果表明(见图5、图6)PAVDA-QD能够对细菌生物膜进行渗透，并均匀地分布在细菌生物膜中。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。但是以上所述仅为本发明的具体实施例，本发明的技术特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在不脱离本发明的技术方案下得出的其他实施方式均应涵盖在本发明的专利范围之中。