博宁霉素在治疗耐药性结核病中的应用

摘要

本发明涉及博宁霉素在治疗耐药性结核病中的应用，具体涉及博宁霉素或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途，其中所述药物用于：(1)抑制结核分枝杆菌的生长或增殖；(2)杀死或杀伤结核分枝杆菌；(3)抑制结核分枝杆菌感染；和/或(4)治疗结核分枝杆菌感染所引起的疾病。结果显示其对敏感型和耐药型结核分枝杆菌均具有显著的抑制活性，具有活性高、生产成本低的优点，为结核病治疗提供了新的选择。

说明书

技术领域

本发明属于结核病治疗领域，具体涉及从轮枝链霉菌平阳变种(StreptomycesVerticillus var.Pingyangensis n.Var)72发酵产物中分离得到的博宁霉素(Boningmycin)在治疗耐药性结核病中的应用。

背景技术

结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起的具有高致死性的传染性疾病，是单一性传染源引起的死亡率最高的疾病(1)。全球约有20亿人携带有MTB，我国是结核病发生率第二高的国家，其中5％～10％的人将有可能发展为TB患者。DOTS方案可以挽救85％的结核病患者的生命。新型抗结核药物及其组合的应用，使得TB的感染率和死亡率相对于2000年有了一定程度的降低。但是TB的防治形势依然严峻，2019年全球依然有1000万新增结核病患者，而死亡患者人数高达120万(不包含20万结核病-艾滋病共感染患者)。这主要是因为TB治疗周期长而导致患者依从性差、加之MTB生理特征特殊，MTB出现了严重的耐药性，包括单药耐药(single drug-resistant，SDR)、多药耐药(multidrug-resistant，MDR)及广泛耐药菌(extensive drug-resistant，XDR)菌株，近年来甚至出现了完全耐药菌(total drug-resistant，TDR)菌株(2)。常规一线、二线抗结核药物已经不能有效治疗由耐药MTB引发的TB，近年来新上市的德拉玛尼(delamanid)和贝塔奎宁(bedaquiline)对多种耐药菌具有良好的治疗效果，但是较大的副作用限制了它们的广泛应用，而且临床也很快发现了对它们具有耐药性的突变菌株(3–5)。可喜的是，2020年PA-824(pretomanid)成功上市，为治疗由耐药MTB尤其是XDR MTB感染引起的TB提供了新的选择(6)。但是全球依然有超过50万株耐药MTB不能被有效治疗(7)，临床对新型抗结核药物的需求依然迫切。

发明内容

博宁霉素是中国医学科学院医药生物技术研究所从浙江省平阳市的土壤中分离到的轮枝链霉菌平阳变种发酵得到的一种新型微生物产物。其具有良好的抗肿瘤活性，可以抑制多种肿瘤细胞的增殖和裸鼠体内肿瘤，如人肝癌、食管癌等的生长。此外，其对银屑病、脂溢性皮炎具有较强的抑制作用，对乳头瘤病毒引起的疾病如尖锐湿疣也具有良好的疗效。但尚未发现其可用于治疗结核病。

在一个方面，本发明涉及博宁霉素或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途，其中所述药物用于：

(1)抑制结核分枝杆菌(例如，耐药性结核分枝杆菌)的生长或增殖；

(2)杀死或杀伤结核分枝杆菌；

(3)抑制结核分枝杆菌感染；和/或

(4)治疗结核分枝杆菌感染所引起的疾病。

在一些实施方案中，所述药物中还含有其它抗结核化合物。

在一些实施方案中，所述其它抗结核化合物为异烟肼、乙胺丁醇、利福平、卡那霉素、卷曲霉素、利奈唑胺或链霉素。

在一些实施方案中，所述结核分枝杆菌为耐药型结核分枝杆菌。

在一些实施方案中，所述结核分枝杆菌为单药耐药、多药耐药、广泛耐药和/或完全耐药的结核分枝杆菌。

本文中所述单药耐药是指对一种一线抗结核药物耐药；所述多药耐药是指对不同时包括异烟肼、利福平在内的一种以上的一线抗结核药物耐药；所述多药耐药是指除了至少对两种主要一线抗结核药物异烟肼、利福平耐药外，还对任何氟喹诺酮类抗生素(如：氧氟沙星)产生耐药，以及三种二线抗结核药物(如：卷曲霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素等)中的至少一种耐药。一线抗结核药物通常指异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、链霉素。

在一些实施方案中，所述结核分枝杆菌为敏感型结核分枝杆菌。在本文中，所述敏感型结核分枝杆菌是指能够被上述任意提到的抗结核药物有效抑制的结核分枝杆菌。

在一些实施方案中，所述疾病为结核病。

在一些实施方案中，所述疾病为肺结核。

在一些实施方案中，所述药物具有80nM以下(例如，80nM以下、75nM以下、70nM以下、65nM以下、60nM以下、55nM以下、50nM以下、45nM以下、40nM以下、35nM以下、30nM以下、25nM以下、20nM以下、15nM以下、10nM以下、5nM以下或1nM以下)的对结核分枝杆菌的最小抑制浓度(MIC)。MIC测定方法可参考本领域已知方法，例如本发明实施例中所述的方法。

用于说明本发明的结核分枝杆菌可以为本领域已知的标准株，例如H37Rv，或由结核病人体内分离得到的临床菌株。

在一些实施方案中，所述药学上可接受的盐为酸加成盐，例如盐酸盐、硫酸盐、醋酸盐、马来酸盐或富马酸盐等。

在一些实施方案中，所述药物为口服制剂或注射剂。

在一些实施方案中，所述药物为片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、口服液体制剂、粉针剂、注射液、混悬剂或乳剂。

在一些实施方案中，所述药物中含有0.01mg～1000mg(例如0.01mg～10mg，0.01mg～50mg，0.01mg～100mg，0.01mg～500mg，0.01mg～1000mg，10mg～50mg，10mg～100mg，10mg～500mg，10mg～1000mg，50mg～100mg，50mg～500mg，50mg～1000mg，100mg～500mg，100mg～1000mg或500mg～1000mg)的博宁霉素或其药学上可接受的盐。

在另一个方面，本发明涉及在有治疗需要的受试者中治疗结核分枝杆菌感染的方法，其包括给所述受试者施用有效量的博宁霉素或其药学上可接受的盐的步骤。

在另一个方面，本发明涉及在有治疗需要的受试者中抑制结核分枝杆菌的生长或增殖的方法，其包括给所述受试者施用有效量的博宁霉素或其药学上可接受的盐的步骤。

在另一个方面，本发明涉及在有治疗需要的受试者中杀死或杀伤结核分枝杆菌的方法，其包括给所述受试者施用有效量的博宁霉素或其药学上可接受的盐的步骤。

在另一个方面，本发明涉及在有治疗需要的受试者中治疗结核分枝杆菌感染所引起的疾病的方法，其包括给所述受试者施用有效量的博宁霉素或其药学上可接受的盐的步骤。

在一些实施方案中，口服或局部施用(例如静脉注射、动脉注射、皮内注射、皮下注射、肌内注射、腹腔注射或脊髓腔注射)博宁霉素或其药学上可接受的盐。

对于本文所述的感染或疾病，博宁霉素或其药学上可接受的盐能够抑制其发生、发展或扩散，引起病症的消退，治愈病症，或以其它方式改善罹患、有风险患有或感染所述疾病的患者的一般健康。因此，“治疗”及“治疗方法”意图包括任何期望的治疗干预，包括但不限于治疗受试者中存在的感染的方法，以及预防(即，防止)感染的方法，诸如在已暴露于本文所列举的结核分枝杆菌或预期将暴露于本文所列举的结核分枝杆菌下的受试者中。

在一些实施方案中，博宁霉素或其药学上可接受的盐的给药量将取决于个体情况、疾病或病症的严重性、给药的速率、化合物的处置及处方医师的判断。一般而言，有效量为约0.001-10000mg/kg受试者体重/天。在合适的情况下，有效量为约0.01-1000mg/kg受试者体重/天。可以每天、每两天或每三天给药约0.01-1000mg/kg受试者体重，通常约0.1-500mg/kg受试者体重。示例性的给药方案为每天一次或多次，或者每周一次或多次，或者每月一次或多次。多次给药时，单次剂量之间的间隔通常可以是每天、每周、每月或每年。或者，可以缓释制剂的形式给药，在这种情况下需要较低的给药频率。给药剂量和频率可根据药物在受试者体内的半衰期而不同，也可以根据是预防性应用还是治疗性应用而不同。在预防性应用中，以相对低频率的间隔长期施用相对低的剂量；在治疗性应用中，有时需要以较短的间隔施用相对高的剂量，直至疾病的进展被延缓或停止，优选直至个体表现出疾病症状的部分或完全改善，此后可以采用预防性应用。

在一些实施方案中，博宁霉素或其药学上可接受的盐在一种或多种其它抗结核化合物之前、之后或同时施用至患者。

在一些实施方案中，所述其它抗结核化合物为异烟肼、乙胺丁醇、利福平、卡那霉素、卷曲霉素、利奈唑胺或链霉素。

在一些实施方案中，所述结核分枝杆菌为耐药型结核分枝杆菌。

在一些实施方案中，所述结核分枝杆菌为单药耐药、多药耐药、广泛耐药和/或完全耐药的结核分枝杆菌。

在一些实施方案中，所述结核分枝杆菌为敏感型结核分枝杆菌。

在一些实施方案中，所述疾病为结核病。

在一些实施方案中，所述疾病为肺结核。

术语“施用(administrate/administrating/administration)”(或“给药”)是指将药物活性成分(比如博宁霉素或其药学上可接受的盐)或其药学上可接受的盐应用于个体或其细胞、组织、器官、生物流体等部位，以便使药物活性成分与个体或其细胞、组织、器官、生物流体等部位接触的过程。

术语“有需求”是指医生或其他护理人员对个体需要或者将要从预防和/或治疗过程中获益的判断，该判断的得出基于医生或其他护理人员在其专长领域中的各种因素。

术语“个体”(或称受试者，患者)是指人类或非人动物。本发明的个体包括患有疾病和/或病症的个体(患者)和正常的个体。本发明的非人动物包括所有脊椎动物，例如非哺乳动物，例如鸟类、两栖类、爬行类等，和哺乳动物，例如非人灵长类、家畜和/或驯化动物(例如绵羊、犬、猫、奶牛、猪等)。

发明的有益效果

本发明提供博宁霉素或其药学上可接受的盐在治疗结核病中的应用，结果显示其对敏感型和耐药型结核分枝杆菌均具有显著的抑制活性，具有活性高、生产成本低的优点，为结核病治疗提供了新的选择。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

博宁霉素(盐酸盐)是中国医学科学院医药生物技术研究所从浙江省平阳市的土壤中分离到的轮枝链霉菌平阳变种发酵得到的一种新型微生物产物，其制备方法可按照中国发明专利申请CN 98101253.1，发明名称：一种抗肿瘤抗生素和其微生物发酵生产法。

1.菌株复苏

本研究中采用的MTB均保存在北京市结核病胸部肿瘤研究所细菌免疫室。将保存于-80℃的Mtb H37Rv(ATCC27294)和临床分离的多药耐药菌株28(对异烟肼INH、利福平RFP和乙硫异烟胺TH具有耐药性)、1527(对异烟肼、利福平和链霉素SM具有耐药性)、1546(对异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇EMB、利福喷丁RFT和乙硫异烟胺具有耐药性)以及1731(对异烟肼，利福平和链霉素具有耐药性)(保存于首都医科大学附属北京胸科医院&北京市结核病胸部肿瘤研究所)分别涂布7H10固体培养基(含10％OADC)，37℃静置培养3～4周。挑取单菌落接种于5mL 7H9液体培养基(含10％OADC和0.05％Tween80)，于37℃静置培养，10～14d后测定菌株的OD600光吸收值，并采用液体培养基将其稀释至光吸收值为0.1，分别吸取1mL至EP管保存至-80℃备用。

2.菌株生长情况监测

于96孔板的第1～3列加入1μL DMSO(阴性对照)，第4～6列加入1μL采用DMSO溶解的浓度为1mg/mL的异烟肼(阳性对照)。之后将(1)中复苏后的H37Rv按接种量1：1000接种于新鲜7H9液体培养基，并将含菌培养液转移至96孔板的第1～9列(每孔100μL)，并向第10～12列加入每孔加入100μL空白培养基(第7～9列为正常生长对照，第10～12列为空白对照)。此后将96孔板采用保鲜膜封闭，置于37℃静置培养。并从第5d开始观察菌株的生长情况。结果表明，从第6d开始，除第4～6，10～12列仍未澄清，阴性对照组和正常生长组的培养液出现浑浊，且二者没有明显区别，表明培养液中含有1％DMSO对MTB的生长没有影响。而阳性对照组的培养液直至21d没有出现生长。

3.博宁霉素对H37Rv的MIC测定

于96孔板中分别设置阴性对照(加入2μL DMSO)，阳性对照(加入2μL浓度为1mg/mL的异烟肼)，以及实验组(2μL博宁霉素盐酸盐样品，浓度从10μM 2倍梯度稀释至0.078μM)，每组3个复孔。将上述1中准备的Mtb H37Rv按1：1000接种于新鲜7H9培养液体基(含10％OADC和0.05％Tween80)，使用排枪将培养液加至96孔板，每孔100μL)。另设空白对照(加入100μL培养基)。最后将96孔密封放至37℃培养箱静置培养10d，观测结果。将化合物完全抑制菌株生长的浓度定义为其MIC。

结果显示，博宁霉素对H37Rv的抑制活性＜0.078μM。

4.博宁霉素对多药耐药Mtb的MIC值

按照3的方法，测定博宁霉素对上述1中所述临床分离的多药耐药菌株的MIC值，结果显示其对该菌株的抑制活性＜0.078μM。

其中，博宁霉素对多药耐药菌28的MIC为0.039μM，对1527的MIC为0.078μM，对1546的MIC为0.039μM，对1731的MIC值为0.039μM。

参考文献

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尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。