一种化学振荡指纹图谱技术鉴定山银花与金银花的方法

摘要

本发明提供了一种化学振荡指纹图谱技术鉴定山银花与金银花的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)向待测样本中加入振荡体系溶液，混合均匀后将得到的混合溶液通过电极与电化学工作站连通，得到化学振荡指纹图谱；(2)对所述的化学振荡指纹图谱进行预处理与特征参数提取，建立特征参数与待测样本中山银花和或金银花的含量的回归关系即成。本发明所述的化学振荡指纹图谱技术鉴定山银花与金银花的方法具有特征性强，灵敏度高，参数范围大等优势，为金银花和山银花的定性定量分析提供了简便的方法；其次，该方法检测时样品无需复杂前处理，且分析成本低，便于方法的进一步普及应用。

说明书

技术领域

本发明属于中药材检测技术领域，尤其是涉及一种化学振荡指纹图谱技术鉴定山银花与金银花的方法。

背景技术

金银花和山银花均系忍冬科植物，二者形态相似，肉眼难以区分，从《中国药典》(2005版)开始将两花分列进入药典目录。金银花为忍冬科植物忍冬L.japonicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花，山银花为忍冬科灰毡毛忍冬L.macranthoidesHand-Mazz.、红腺忍冬LhypoglaucaMiq.、华南忍冬LConfiusaDC.或黄褐毛忍冬LfiulvotomentosaHsuetS.C.Chen的干燥花蕾或带初开的花。《中国药典》(2020版)规定，金银花的含量测定标准为绿原酸≥1.5％、酚酸类≥3.8％和木犀草苷≥0.050％；山银花的含量测定标准为绿原酸≥2.0％、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的总量≥5.0％。近年来，金银花在中医药领域和食品行业中的应用日趋广泛，价格持续走高，而山银花产量大，价格相对便宜，导致市场上金银花中混有山银花甚至用山银花代替金银花的现象屡见不鲜。因此，探寻一种有效、简便、经济的金银花和山银花混合品的鉴定分析方法十分必要。

目前，金银花和山银花及制剂的质量控制主要依据高效液相色谱(HPLC)法、气相色谱(GC)法、紫外-可见分光光度(UV-Vis)法、毛细管电泳(CE)法、液-质联用技术(HPLC-MS)等进行单成分或多成分的测定。这种单凭若干个成分的分析指标来确定药材质量评价的方法极易给不法商贩以可乘之机。因此，亟待需要针对山银花和金银花混合药材的定性和定量判别开发综合性更高、灵敏度更优的分析检测方法。

化学振荡指纹图谱是指在一定振荡体系下，通过监测体系氧化还原电位值随时间变化而获得的图谱。当中药加入体系中，对空白振荡体系产生扰动，此时获取的图谱称为该中药的化学振荡指纹图谱。目前的应用实践表明，中药化学振荡指纹图谱技术具有整体性强、特征参数多、信息丰富、样品无需复杂处理、分析成本低等特点。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种化学振荡指纹图谱技术鉴定山银花与金银花的方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种化学振荡指纹图谱技术鉴定山银花与金银花的方法，包括如下步骤：

(1)向待测样本中加入振荡体系溶液，混合均匀后将得到的混合溶液通过电极与电化学工作站连通，得到化学振荡指纹图谱；

(2)对所述的化学振荡指纹图谱进行预处理与特征参数提取，建立特征参数与待测样本中山银花和或金银花的含量的回归关系即成。

进一步，所述的步骤(1)中的振荡体系溶液包括酸液、催化剂、耗散物与氧化剂；所述的酸液为稀硫酸溶液；所述的催化剂为铜离子溶液、铈离子溶液、锰离子溶液或铁离子溶液中的至少一种；所述的耗散物为丙酮、丙二酸、柠檬酸、丁二酸或双氧水中的至少一种；所述的氧化剂为高氯酸根离子溶液、碘酸根离子溶液、溴酸根离子溶液或溴酸中的至少一种；所述的步骤(1)中的向待测样本中加入振荡体系溶液的具体步骤为：向待测样本中加入酸液、催化剂和耗散物，搅拌后加入氧化剂，混合均匀后即成；所述的搅拌步骤具体为：在温度为35-42℃，转速为800-1200r/min的条件下搅拌8-15min。

进一步，所述的步骤(1)中的待测样本与振荡体系溶液的固液比为1：(100-150)；所述的酸液、催化剂、耗散物与氧化剂的体积比为1：(0.75-1)：(0.5-0.75)：(0.25-0.5)；所述的酸液的浓度为0.72-0.80mol/L；所述的催化剂的浓度为0.0018-0.0020mol/L；所述的氧化剂的浓度为0.072-0.080mol/L。

进一步，所述的步骤(2)中的特征参数为峰谷时间、峰谷电位、峰顶时间、峰顶电位、诱导时间、起波电位、振荡周期、振荡次数、振荡寿命、最大振幅、停波时间或停波电位中的至少一种；优选的，所述的特征参数为诱导时间、振荡周期、峰谷时间、停波时间、峰顶时间或振荡寿命中的至少一种；更优选的，所述的特征参数为诱导时间。

进一步，所述的步骤(2)中的回归关系的公式为：Y

进一步，所述的步骤(2)中的预处理步骤的方法为最小二乘平滑、Savitzky-Golay平滑或Gauss模糊处理中的至少一种。

进一步，所述的步骤(1)中的待测样本经粉碎过筛后得到；所述的过筛步骤的筛网的粒径为80-120目；所述的步骤(1)中的待测样本中山银花的含量为0.014-100％；所述的步骤(1)中的待测样本中金银花的含量为0-99.986％。

进一步，所述的步骤(1)中的电极具体为：以铂丝电极为指示电极，饱和甘汞电极为参比电极；所述的步骤(1)中的化学振荡指纹图谱的记录时间范围为0-3500秒，采样间隔为0.1-0.2秒。

所述的方法的应用，所述的方法在混合物样本中鉴别山银花和或金银花中的应用。

所述的方法的应用，所述的方法在混合物样本中测定山银花和或金银花的含量中的应用。

相对于现有技术，本发明具有以下优势：

本发明所述的化学振荡指纹图谱技术鉴定山银花与金银花的方法具有特征性强，灵敏度高，参数范围大等优势，为金银花和山银花的定性定量分析提供了简便的方法；其次，该方法检测时样品无需复杂前处理，且分析成本低，便于方法的进一步普及应用；更为重要的是，本方法对药材的质控分析是基于药材整体氧化还原活性的分析，整体性强，避免了单一或若干组分检测不能全面反应药材质量的局限性问题，为药材的整体质量评价提供了新方法，新思路。

附图说明

图1为本发明实施例1所述的金银花、金银花和山银花混合物、山银花的化学振荡指纹图谱：曲线A为山银花，曲线B为金银花和山银花混合物，曲线C为金银花；

图2为本发明实施例2所述的诱导时间、振荡周期、峰谷时间、停波时间、峰顶时间和振荡寿命与山银花含量的线性关系图：2-A为诱导时间，2-B为振荡周期，2-C为停波时间，2-D为峰谷时间，2-E为峰顶时间，2-F为振荡寿命；

图3为本发明实施例2所述的诱导时间与金银花含量线性关系图。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例中的铂丝电极和饱和甘汞电极均购于上海辰华仪器公司。

本发明实施例中的金银花药材购于河南，山银花药材购于湖南。

下面结合实施例来详细说明本发明。

本发明实施例1-4中所述的混合药材均由金银花药材和山银花药材粉碎过筛后按照一定比例混合。

其中，实施例1制备混合药材A的质量分数分别为：山银花100％，金银花0；制备混合药材B的质量分数分别为：山银花40％，金银花60％；制备混合药材C的质量分数分别为：山银花0，金银花100％；

实施例2中制备混合药材D的质量分数分别为：山银花100％，金银花0；制备混合药材E的质量分数分别为：山银花80％，金银花20％；制备混合药材F的质量分数分别为：山银花60％，金银花40％；制备混合药材G的质量分数分别为：山银花40％，金银花60％；制备混合药材H的质量分数分别为：山银花20％，金银花80％；制备混合药材I的质量分数分别为：山银花0.014％，金银花99.986％；

实施例3中制备混合药材J的质量分数分别为：山银花30％，金银花70％；

实施例4中制备混合药材K的质量分数分别为：山银花90％，金银花10％。

本发明实施例5中混合药材L的前处理过程为：取市售野生银花露(湖北食为天药业股份有限公司，标识量0.0625g/mL)30.7mL，减压蒸馏浓缩到3.07mL，取浓缩后液体0.0307mL，向其中添加山银花粉末0.38g后得到的混合药材，其中，山银花的质量分数为95％，金银花的质量分数为4.8％,其他杂质含量0.2％。

实施例1含有山银花和或金银花的混合药材的化学振荡指纹图谱测试

在温度为35℃，转速为800r/min的条件下，向三口瓶中依次加入粉碎过80目筛后的混合药材A 0.4g、0.72mol/L的稀硫酸溶液、0.0018mol/L的硫酸铜催化剂溶液与丙酮耗散物溶液，搅拌8min后加入0.072mol/L的溴酸钾氧化剂溶液，酸液、催化剂、耗散物与氧化剂的体积分别为16mL，12mL，8mL，4mL。以铂丝电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，立即开启电化学工作站，记录化学振荡指纹图谱到2800秒，采样间隔为0.1秒。图1中的A曲线为山银花药材的化学振荡指纹图谱。

重复上述操作，不同之处在于：将待测样本替换为混合药材B，记录化学振荡指纹图谱调整到3000秒，其他条件不变，得到含有山银花和金银花的混合药材的化学振荡指纹图谱，如图1中B曲线所示。

重复上述操作，不同之处在于：将待测样本替换为混合药材C，记录化学振荡指纹图谱调整到3500秒，其他条件不变，得到金银花药材的化学振荡指纹图谱，如图1中C曲线所示。

实施例2含有山银花和或金银花的混合药材的含量测定方法建立

在温度为35℃，转速为800r/min的条件下，向三口瓶中依次加入粉碎过80目筛后的混合药材D 0.4g、0.72mol/L的稀硫酸溶液、0.0018mol/L的硫酸铜催化剂溶液与丙酮耗散物溶液，搅拌8min后加入0.072mol/L的溴酸钾氧化剂溶液，酸液、催化剂、耗散物与氧化剂的体积分别为16mL，12mL，8mL，4mL。以铂丝电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，立即开启电化学工作站，记录化学振荡指纹图谱到3000秒，采样间隔为0.1秒。

依次重复上述操作，不同之处在于：将待测样本分别替换为混合药材E；到混合药材E的化学振荡指纹图谱；

依次重复上述操作，不同之处在于：将待测样本分别替换为混合药材F；到混合药材F的化学振荡指纹图谱；

依次重复上述操作，不同之处在于：将待测样本分别替换为混合药材G；到混合药材G的化学振荡指纹图谱；

依次重复上述操作，不同之处在于：将待测样本分别替换为混合药材H；到混合药材H的化学振荡指纹图谱；

依次重复上述操作，不同之处在于：将待测样本分别替换为混合药材I；到混合药材I的化学振荡指纹图谱。

对得到的所有化学振荡指纹图谱进行最小二乘平滑处理，提取峰谷时间、峰谷电位、峰顶时间、峰顶电位、诱导时间、起波电位、振荡周期、振荡次数、振荡寿命、最大振幅、停波时间和停波电位特征参数，考察这些特征参数与山银花和或金银花含量的线性关系，建立山银花和或金银花含量的最佳测试方法。图2分别为为诱导时间、振荡周期、峰谷时间、停波时间、峰顶时间和振荡寿命与山银花含量的线性关系，其中，诱导时间与山银花含量的线性相关性最佳，诱导时间(Y

实施例3含有山银花的混合药材中山银花含量的测定

在温度为42℃，转速为1200r/min的条件下，向三口瓶中依次加入粉碎过120目筛后的混合药材J 0.4g、0.80mol/L的稀硫酸溶液、0.0020mol/L的硫酸锰催化剂溶液与丙二酸耗散物溶液，搅拌15min后加入0.080mol/L的碘酸钾氧化剂溶液，酸液、催化剂、耗散物与氧化剂的体积分别为16mL，12mL，8mL，4mL。以铂丝电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，立即开启电化学工作站，记录化学振荡指纹图谱到3000秒，采样间隔为0.1秒。提取诱导时间为1461s，根据诱导时间(Y

实施例4含有金银花的混合药材中金银花含量的测定

在温度为40℃，转速为1000r/min的条件下，向三口瓶中依次加入粉碎过100目筛后的混合药材K 0.4g、0.80mol/L的稀硫酸溶液、0.0020mol/L的硫酸锰催化剂溶液与丙酮耗散物溶液，搅拌10min后加入0.080mol/L的溴酸钾氧化剂溶液，酸液、催化剂、耗散物与氧化剂的体积分别为16mL，12mL，8mL，4mL。以铂丝电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，立即开启电化学工作站，记录化学振荡指纹图谱到3000秒，采样间隔为0.1秒。提取诱导时间为1609s，根据诱导时间(Y

实施例5含有山银花和金银花的混合药材的含量测定

在温度为40℃，转速为1000r/min的条件下，向三口瓶中加入混合药材L，再加入0.80mol/L的稀硫酸溶液、0.0020mol/L的硫酸锰催化剂溶液与丙酮耗散物溶液，搅拌10min后加入0.080mol/L的溴酸钾氧化剂溶液，酸液、催化剂、耗散物与氧化剂的体积分别为16mL，12mL，8mL，4mL。以铂丝电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，立即开启电化学工作站，记录化学振荡指纹图谱到3000秒，采样间隔为0.1秒。根据诱导时间1631s，计算得到山银花含量为96％，金银花含量为4.2％，与真实值基本吻合，说明本方法准确度高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。