一种具有多级有序结构的生物活性仿生纤维结缔组织及制备方法与仿生肌腱、仿生韧带

摘要

本发明公开了一种具有多级有序结构的生物活性仿生纤维结缔组织及制备方法与仿生肌腱、仿生韧带。所述生物活性仿生纤维结缔组织的制备方法，包括步骤：将活性纳米材料与生物墨水混合得到打印浆料，其中，所述活性纳米材料含有成骨和/或成腱的活性离子；将所述打印浆料进行3D打印制备得到复合水凝胶支架；将所述复合水凝胶支架拉伸并干燥处理，制备得到所述生物活性仿生纤维结缔组织。本发明能够制备出具有多级有序结构的生物活性仿生纤维结缔组织，且具有制备工艺简单，易于操作的优点，有利于工业推广和应用。

说明书

技术领域

本发明涉及医用生物材料技术领域，尤其涉及一种具有多级有序结构的生物活性仿生纤维结缔组织及制备方法与仿生肌腱、仿生韧带。

背景技术

每一块骨骼肌都分成肌腹和肌腱两部分，其中，肌腱由致密纤维结缔组织构成，通过肌腱将把骨骼肌附着于骨骼。韧带是致密纤维结缔组织，附着于骨骼的可活动部分，但限制骨骼活动范围以免损伤。一般来说，韧带连接骨与骨，而肌腱连接的是骨和肌肉。

以肌腱损失或韧带损失为代表的运动损伤正在不断地困扰着现代人的健康生活，损伤严重的患者往往需要进行外科手术治疗。尽管近20年来，以关节镜下重建前交叉韧带手术为代表的外科手术已经成为骨科与运动医学领域最成功的手术技术之一，但手术失败及二次翻修的比率仍高达10％以上，且手术重建后的前交叉韧带很难恢复原有的力学强度。其他肌腱或韧带康复手术，例如肩袖撕裂修补手术、跟腱撕裂修补手术也都存在类似的高复发率和低愈合率。这其中一个共同的原因就是腱骨界面愈合效果不理想。因此，发展新的能够促进腱骨界面组织修复的人工肌腱或韧带材料极具科学意义和临床应用价值。然而，现有制备人工肌腱或韧带材料工艺相对复杂且难以实现多尺度结构的有序调控。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有多级有序结构的生物活性仿生纤维结缔组织及制备方法与仿生肌腱、仿生韧带，旨现有制备人工肌腱或韧带材料工艺相对复杂且难以实现多尺度结构的有序调控。

一种具有多级有序结构的生物活性仿生纤维结缔组织的制备方法，其中，包括步骤：

将活性纳米材料与生物墨水混合得到打印浆料，其中，所述活性纳米材料含有成骨和/或成腱的活性离子；

将所述打印浆料进行3D打印制备得到复合水凝胶支架；

将所述复合水凝胶支架拉伸并干燥处理，制备得到所述生物活性仿生纤维结缔组织。

所述的具有多级有序结构的生物活性仿生纤维结缔组织的制备方法，其中，

所述将所述打印浆料进行3D打印制备得到复合水凝胶支架之后，还包括：将所述复合水凝胶支架进行交联处理。

所述的具有多级有序结构的生物活性仿生纤维结缔组织的制备方法，其中，所述交联处理包括：钙离子交联处理、紫外照射交联处理、戊二醛交联处理中一种或多种方式。

所述的具有多级有序结构的生物活性仿生纤维结缔组织的制备方法，其中，所述活性纳米材料包括硅酸钙纳米线，羟基磷灰石纳米棒，埃及蓝类纳米片中的一种或多种。

所述的具有多级有序结构的生物活性仿生纤维结缔组织的制备方法，其中，所述生物墨水包括海藻酸、明胶、壳聚糖、透明质酸中的一种或多种。

所述的具有多级有序结构的生物活性仿生纤维结缔组织的制备方法，其中，所述拉伸并干燥处理的过程中，所述复合水凝胶支架的拉伸比率为不大于50％。

所述的具有多级有序结构的生物活性仿生纤维结缔组织的制备方法，其中，所述打印浆料的固液质量百分比为10％～20％。

一种仿生纤维结缔组织，其中，采用如上所述具有多级有序结构的生物活性仿生纤维结缔组织的制备方法制备得到。

一种仿生肌腱，其中，包括如上所述仿生纤维结缔组织。

一种仿生韧带，其中，包括如上所述仿生纤维结缔组织。

有益效果：本发明通过打印程序精确控制复合水凝胶支架的宏观结构(毫米级结构)；同时活性纳米材料在通过3D打印针头时会受到流体剪切作用而进行有序排列，形成纳米级有序结构；进一步，将所述复合水凝胶支架拉伸并干燥处理会使得复合水凝胶支架的表面形成沿着拉伸方向有序排列的微米级纤维束结构，从而制备出具有多级有序结构的生物活性仿生纤维结缔组织。本发明提供的仿生纤维结缔组织制备工艺简单，易于操作，有利于工业推广和应用。

附图说明

图1是本发明实施例提供的生物活性仿生纤维结缔组织的制备方法流程图。

图2是本发明实施例1提供的样品透射电子显微镜(TEM)图片。

图3是本发明实施例2提供的样品扫描电子显微镜(SEM)图片。

图4是本发明实施例2及实施例3所制备的水凝胶支架样品的扫描电子显微镜(SEM)照片。

图5是本发明实施例4提供的仿生纤维结缔组织样品扫描电子显微镜(SEM)图片。

图6是本发明实施例5中组织切片染色(H&E)图片。

具体实施方式

本发明提供一种具有多级有序结构的生物活性仿生纤维结缔组织及制备方法与仿生肌腱、仿生韧带，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

研究发现，调控人工肌腱或韧带材料的结构与组成是实现腱骨修复的重要方法。组成上来说，目前的人工肌腱或韧带普遍缺乏生物活性，尤其是成骨活性，难以满足腱骨界面完美愈合的要求。结构上来说，构建多级有序仿生结构是提高材料修复性能的重要方法，但目前的制备工艺相对复杂且难以实现多尺度结构的有序调控。

本发明提供一种具有多级有序结构的生物活性仿生纤维结缔组织的制备方法，其中，包括步骤：

S100、将活性纳米材料与生物墨水混合得到打印浆料，其中，所述活性纳米材料含有成骨和/或成腱的活性离子；

S200、将所述打印浆料进行3D打印制备得到复合水凝胶支架；

S300、将所述复合水凝胶支架拉伸并干燥处理，制备得到所述生物活性仿生纤维结缔组织。

在本实施例中，复合水凝胶支架的宏观结构(毫米级结构)由打印程序精确控制；同时活性纳米材料在通过挤出式3D打印针头时会受到流体剪切作用而进行有序排列，形成纳米有序结构；进一步，将所述复合水凝胶支架拉伸并干燥处理会使得复合水凝胶支架中的纤维结构沿着拉伸方向有序排列，在表面形成微米级的纤维束结构。可见，本发明最终制得具有纳米-微米-毫米多级分层有序结构的生物活性仿生纤维结缔组织。本发明提供的人工肌腱或韧带制备工艺简单，易于操作，有利于工业推广和应用。

所述活性纳米材料既能够释放促进成骨或成腱的活性离子，又能够作为纳米颗粒对复合体系进行力学增强。将所述复合水凝胶支架拉伸并干燥处理实现对所述复合水凝胶支架的定向干燥处理，能够使仿生纤维结缔组织力学强度进一步增强，有效地促进腱骨缺损部位组织的愈合，有望作为更有效的人工肌腱或韧带。

本实施例制备的仿生纤维结缔组织具有较高的力学强度，能够提供一定的力学支撑。其多级分层有序结构能够更好地通过“接触引导”的方式诱导细胞在支架表面进行有序排列，重组细胞骨架并通过力学信号刺激促进细胞增殖及分化，而包裹在里面的纳米颗粒则能够降解释放Ca，Si，P，Cu，Sr等生物活性离子，促进缺损部位的相关细胞的定向分化，增强骨及肌腱组织的再生。因此，本实施例制备的仿生纤维结缔组织材料可以作为人工肌腱或韧带用于腱骨损伤的修复，具有很好的临床应用前景。

所述S100是制备一种可用于3D打印的打印浆料，其中，所述打印浆料中添加有活性纳米材料。所述活性纳米材料通常是活性纳米颗粒。

在本发明的一个实施方式中，所述活性纳米材料包括硅酸钙纳米线，羟基磷灰石纳米棒，埃及蓝类纳米片中的一种或多种。本实施方式中，所述活性纳米材料均由人体必须的微量元素组成，能够在生物体内降解并释放Ca，Si，P，Cu，Sr等生物活性离子，促进腱骨组织的愈合，同时所述活性纳米材料还能起到力学增强的作用。

所述生物墨水，是可用于3D打印机的墨水。在本发明的一个实施方式中，所述生物墨水包括海藻酸、海藻酸盐(如海藻酸钠)、藻酸盐、明胶、壳聚糖、透明质酸中的一种或多种，但不限于此。所述生物墨水具有能够在定向干燥后得到表面具有微米级的纤维结构。

所述S200是通过3D打印的方法制备复合水凝胶支架。在本发明的一个实施方式中，所述将所述打印浆料进行3D打印制备得到复合水凝胶支架之后，还包括：S202、将所述复合水凝胶支架进行交联处理。

也即是，所述S200包括：

S201、将所述打印浆料进行3D打印制备得到复合水凝胶支架；

S202、将所述复合水凝胶支架进行交联处理。

其中，S201是将打印浆料通过3D打印机，打印得到预定形状的未交联的复合水凝胶支架。所述未交联的复合水凝胶支架是指未进行交联处理的复合水凝胶支架半成品。

S202是将复合水凝胶支架半成品在一定条件下，使复合水凝胶支架中完成交联，能够进一步提高复合水凝胶支架的力学性能。是否对复合水凝胶支架进行交联处理可以根据不同生物墨水的交联需要确定。

在本发明的一个实施方式中，所述交联处理包括：钙离子交联处理、紫外照射交联处理、戊二醛交联处理中一种或多种方式。可以理解的是，具体的交联方式取决于所用生物墨水的类型，所述交联处理不限于上述交联处理，例如，所述交联处理还可以是加热交联处理。

举例地，采用钙离子对基于海藻酸钠制备的未交联的复合水凝胶支架进行交联。戊二醛(GA)是一种饱和直链二羰基化合物，由于分子两端各有一个反应性能强的醛基,GA被作为生物组织固定剂之后,经GA处理的生物软组织成功地用于人体脏器的修复和置换，而且所述戊二醛分子与氨基交联。

本发明将复合水凝胶支架拉伸并干燥处理是对复合水凝胶支架进行定向干燥。拉伸比率会对取向结构有一定影响，在一些实施方式中，定向干燥时，复合水凝胶支架被拉伸后固定，拉伸比率为0～50％，如5％、25％、30％等。在上述拉伸比率范围内，所述复合水凝胶支架表面可以形成直径为0.2～50μm的有序纤维束排列结构。

在一些实施方式中，所述活性纳米材料在与海藻酸钠的质量百分比为2％～30％，在此范围内，所得的人工肌腱或韧带力学强度及生物学性能均较佳，超出此范围会由于活性离子释放少而达不到治疗效果或者由于活性离子释放过多而产生毒性。在本发明的一个实施方式中，所述打印浆料的固液质量百分比为10％～20％，所得的浆料的流变性较好，适合挤出式3D打印。

在一些实施方式中，所述3D打印为挤出式3D打印，3D打印所用针头为23G～32G，打印的参数包括：单层厚度0.05～0.5mm，打印速度1～20mm/s，气压为100～800KPa。

本发明提供一种仿生纤维结缔组织，其中，采用如上所述具有多级有序结构的生物活性仿生纤维结缔组织的制备方法制备得到。

所述生物活性仿生纤维结缔组织具有纳米-微米-毫米多级分层有序结构，所述生物活性仿生纤维结缔组织的复合水凝胶支架可以具有毫米级宏观结构，其表面具有有序排列的纤维结构以及纳米颗粒有序排列的纳米有序结构。其中，本发明所述纳米颗粒既能够释放促进成骨或成腱的活性离子，又能够作为纳米颗粒对复合体系进行力学增强。定向干燥后的仿生纤维结缔组织力学强度进一步增强，能够有效地促进缺损部位腱骨组织的愈合，有望作为更有效的人工肌腱或韧带。

进一步，采用本发明上述制备方法得到的材料可以用于腱骨损伤修复。也即是，本发明还提供具有多级有序结构的生物活性仿生肌腱或韧带的应用，将本发明所述仿生纤维结缔组织材料作为人工肌腱或韧带用于腱骨损伤的修复。一方面，通过3D打印实现了仿生纤维结缔组织的组成与结构的同时调控，活性纳米材料可以既作为功能元素又起到了结构调控的作用。另一方面，通过仿生纤维结缔组织组成和结构的双重调控协同促进腱骨界面组织修复：组成上，将有成腱潜力的生物墨水与有利于成骨的纳米颗粒复合；结构上，构建了有利于组织再生的多级有序结构，从而同时调控组成和结构来协同促进腱骨组织的再生。

具体地，本发明提供一种仿生肌腱，其中，包括如上所述仿生纤维结缔组织。本发明提供一种仿生韧带，其中，包括如上所述仿生纤维结缔组织。也就是，可以将本发明制备的仿生纤维结缔组织作为仿生肌腱或仿生韧带。

下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

配制40毫升浓度为0.4摩尔/升的Ca(NO

本实施例制备得到的活性纳米材料样品(硅酸钙纳米线)的透射电子显微镜(TEM)照片如附图2所示。

附图2显示本实施例制得的硅酸钙纳米线直径20～50nm，长度1～3μm。

实施例2

取实施例1中硅酸钙纳米线0.2克与2克海藻酸均匀混合后加入12克去离子水搅拌均匀形成打印浆料。选用27G打印针头，根据预先设置好的打印参数对复合材料进行3D打印，具体参数包括单层厚度0.15mm，打印速度2mm/s，气压为500KPa。3D打印完成后，将得到的复合水凝胶支架半成品在1摩尔/升CaCl

本实施例制备得到的水凝胶支架样品的扫描电子显微镜(SEM)照片如附图3中a所示。

附图3的扫描电子显微镜(SEM)照片a显示所制得的硅酸钙纳米线有序排列于复合水凝胶中，而附图3的扫描电子显微镜(SEM)照片b显示作为对照的非3D打印样品中硅酸钙纳米线排列杂乱无章。

实施例3

在实施例2的基础上，将27G打印针头分别替换为23G打印针头，25G打印针头，其他步骤不变。

附图4中a-c分别使用了23G，25G和27G号针头所制备的水凝胶支架样品的扫描电子显微镜(SEM)照片。可见，不同针头大小对硅酸钙纳米线取向排布有一定的影响，具体地，随着打印针头大小的减小，硅酸钙纳米线排列逐渐取向度逐渐增加。

实施例4

将实施例2中得到的3D打印复合水凝胶支架两端固定，在室内常温下充分干燥2天后，最终得到海藻酸/硅酸钙多级有序仿生纤维结缔组织。

本实施例所用的固定样品装置包括底座、设在所述底座上的两个夹持组件、用于调节所述两个夹持组件之间距离的螺杆；其中，所述螺杆一端与所述底座螺纹连接，所述螺杆另一端与其中一个夹持组件转动连接。将复合水凝胶支架两端固定在两个夹持组件上，调节两个夹持装置之间的距离，即可得到实现对复合水凝胶支架的拉伸。本实施例所得仿生纤维结缔组织样品表面形貌如附图5所示。

实施例5

将实施例3中得到的仿生纤维结缔组织作为人工肌腱植入兔子受损跟腱部位，手术缝合后饲养2个月观察缺损部位的修复情况。

附图6的苏木精-伊红染色(H&E)照片显示本实施例制得的样品应用于兔子跟腱损伤修复的2个月后，观察到明显的腱骨融合，表明材料有很好的腱骨修复效果。

综上所述，本发明巧妙地利用3D打印技术将生物活性纳米材料有序排列到水凝胶中，制备出毫米尺度以上的复合水凝胶，再通过定向干燥技术在水凝胶表面构建微米有序结构，从而制备出具有纳米-微米-毫米多尺度分层有序结构的人造肌腱或韧带。同时活性纳米材料能够降解并释放Ca，Si，P，Cu，Sr等生物活性离子，促进腱骨组织的愈合，最终实现组成/结构双调控的生物活性仿生肌腱或韧带的构建。本发明所提供的制备方法工艺简单，制备过程可以在室温下进行，操作简单，制备成本低，符合工业生产的要求。人造肌腱或韧带的构建元素均为人体安全的生物高分子或者生物活性陶瓷，具备良好的生物相容性，生物可降解性和生物活性，具有良好的应用前景。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。