基于DNA合成银纳米团簇与色氨酸光化学反应的血浆色氨酸和白蛋白联合检测方法

摘要

本发明公开了一种基于DNA合成银纳米团簇与色氨酸光化学反应的血浆色氨酸和白蛋白联合检测方法。本发明采用的信号探针ShC的序列如SEQ ID NO:1所示，采用其合成的银纳米团簇AgNCs/ShC与能特异性捕获色氨酸的捕获探针HpG形成独特的光化学反应中心，产生特异性荧光增强信号，进行色氨酸检测，进而提高色氨酸检测特异性。同时，利用白蛋白对色氨酸‑DNA合成银纳米团簇光化学传感体系的荧光淬灭效应，实现对白蛋白的联合检测。该检测体系无需对探针进行任何额外标记，仅需配置反应混合液，并紫外照射，即可在普通荧光酶标仪上进行结果读取，其反应时间短，无需使用大型仪器，具有可推广性或实现床边检测的潜力。

说明书

技术领域

本发明涉及医学和分子诊断领域，涉及一种血浆色氨酸和白蛋白荧光检测方法，尤其是涉及一种基于DNA合成银纳米团簇与色氨酸光化学反应的血浆色氨酸和白蛋白联合检测方法。

背景技术

色氨酸(Trp)是人体必需氨基酸，参与蛋白质生物合成，同时，也是多种生物活性物质的前体原料。绝大多数色氨酸通过吲哚胺2,3-双加氧酶IDO或色氨酸2,3-双加氧酶TDO介导的犬尿氨酸途径(KP)进行分解代谢，生成大量可参与炎症或免疫响应的中间产物，且其终产物NAD

传统血浆色氨酸检测方法多依赖于色谱-质谱或色谱-荧光等联用技术，仪器操作复杂，价格昂贵(Laich A,et al.Clinical Chemistry 2002,48(3):579-581.)。更为重要的是，在血液循环系统中，色氨酸是唯一结合在白蛋白HSA上进行转运的氨基酸。然而，现有报道的血浆色氨酸检测方法，大多直接进行了去蛋白操作，实际仅测定了游离色氨酸，没能反映白蛋白上的结合色氨酸含量(徐开成等，中国药科大学学报2016，47(06)：714-718.)。因此，亟需发展新型血浆色氨酸检测方法，解决传统检测面临问题。

DNA合成银纳米团簇(DNA-templated silver nanoclusters，AgNCs/DNA)技术的兴起，为开发新型简便的色氨酸检测方法提供了新思路。作为由几十个银原子组装形成的集合体，AgNCs/DNA尺寸小于1nm，且合成步骤简单、荧光可调，仅通过改变所用DNA模板的长度、序列或结构，就可实现对AgNCs光学性能的调控(Liu J.Trends in AnalyticalChemistry 2014,58:99-111.)。加之，所用化学合成DNA模板可根据碱基互补配对原则与靶核酸进行杂交，或可利用组建的适配体序列与包括金属离子、小分子代谢物、蛋白质甚或细胞表面受体等一系列靶标结合，进而衍生出众多新型生物传感检测策略。随着AgNCs/DNA的富G序列杂交荧光增强效应的发现(Yeh HC,et al.Nano Lett,2010,10:3106-3110.)，为开发高特异性的荧光点亮(light-up)检测策略开辟了新的道路。

近年来，随着越来越多代谢小分子适配体的发现，使开发基于AgNCs/DNA结合适配体的色氨酸精准快捷检测方法成为可能。2010年中国科学院化学研究所报道了L-色氨酸适配体Trp3a-1可实现手性分离D/L-色氨酸，进而用于捕获L-色氨酸或含L-色氨酸的肽段(Yang X et al.Analyst 2011,136(3):577-585.)。值得注意的是，色氨酸具有光敏性，在紫外光作用下通过吲哚基团的C2位与含嘧啶的DNA发生耦联(Reeve AE,etal.Photochemistry&Photobiology 2010,31(4):297-304.)。此外，色氨酸也可以和银离子反应形成配合物，进而可用于合成银纳米颗粒，且紫外照射可以加速其生成进程(Mukha I,et al.Research on Chemical Intermediates 2019,45(8):4053-4066.)。因此，可以预见以色氨酸为反应中心，AgNCs/DNA结合适配体会形成独特的光化学传感体系，进而为开发新的色氨酸检测策略奠定基础。然而，尚未见采用AgNCs/DNA结合适配体进行色氨酸检测的相关报道，其难点在于较难得到特异性响应色氨酸的荧光增强检测体系。因为代谢小分子色氨酸作为检测靶标，不同于核酸分子靶标，设计时可依据碱基互补配对原则进行。色氨酸靶标检测只能借助最终荧光性能变化，设计探针序列，逐一筛选。为此，本发明借助mfold构型分析、非变性PAGE电泳和荧光性能表征等技术，通过缩短信号探针长度，减少其与捕获探针色氨酸适配体区的干扰，筛选得到具有色氨酸依赖的荧光点亮功能的信号探针和相应捕获探针。同时，利用色氨酸、核酸和银原子的光化学反应，作为荧光信号促发机制，不同于现有AgNCs/DNA在检测中应用的单纯依赖于AgNCs的荧光发光机制，为血浆色氨酸检测提供了一种简便的无标记检测方法。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种基于DNA合成银纳米团簇与色氨酸光化学反应的血浆色氨酸和白蛋白联合检测方法，通过构建基于DNA合成银纳米团簇的色氨酸光化学传感体系，将其用于血浆色氨酸及白蛋白联合检测。具体是利用仅与捕获探针颈区互补的DNA，合成银纳米团簇(AgNCs/DNA)作为信号探针，以含富G垂悬端和色氨酸适配体的发夹型DNA为捕获探针，构建色氨酸光化学传感体系(色氨酸-AgNCs/DNA)，分析体系色氨酸响应的灵敏度和特异性，最终将其用于脓毒症血浆色氨酸和白蛋白检测。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供了一种信号探针ShC，序列如SEQ ID NO：1所示。所述ShC为仅与捕获探针HpG颈区互补的核酸序列，其包含3’端富C序列AgNCs生成区和5’端Trp3a-1互补区，后者与HpG捕获探针的Trp3a-1颈区互补配对。

所述信号探针ShC可用于合成银纳米团簇AgNCs/ShC。

第二方面，本发明提供了一种基于前述ShC的序列合成的银纳米团簇信号探针AgNCs/ShC。

第三方面，本发明提供了一种基于前述的银纳米团簇信号探针AgNCs/ShC在血浆色氨酸及白蛋白检测中的应用。

本发明的检测体系以AgNCs/ShC为信号探针，含富G序列垂悬端的HpG为捕获探针，借助富G序列介导色氨酸荧光增强效应，及白蛋白对该体系的荧光淬灭效应，在490nm波长激发下，分别实现色氨酸和白蛋白检测。本发明通过构建含色氨酸适配体的捕获探针，特异性捕获色氨酸，并与DNA合成银纳米簇信号探针(AgNCs/ShC)形成独特的光化学反应中心，产生特异性荧光增强信号，进行色氨酸检测，进而提高色氨酸检测特异性。

第四方面，本发明提供了一种基于前述的银纳米团簇信号探针AgNCs/ShC的血浆色氨酸的检测体系，以总体积为50μL计，包括以下体积和浓度的各组分：

优选地，所述HpG含富G序列垂悬端(含色氨酸适配体的富G发夹型捕获探针，G-rich hairpin DNA)，其序列如SEQ ID NO：2所示；其包含5’富G垂悬端和发夹型色氨酸适配体Trp3a-1区。

所述处理后血浆样本的具体处理方法为：向血浆样本中加入月桂酸钠储备液，吹打混匀后于37℃水浴1～2h；随后，加入3倍体积乙腈和甲醇的有机混合液，涡旋震荡；最后进行离心，收取上层清液即为处理后的血浆样本。

所述缓冲液Pi为磷酸氢二钠与磷酸二氢钠的混合液，pH为6.6(25℃)。

第五方面，本发明提供了一种基于前述的银纳米团簇信号探针AgNCs/ShC的血浆白蛋白的检测体系，以总体积为50μL计，包括以下体积和浓度的各组分：

优选地，所述HpG含富G序列垂悬端(含色氨酸适配体的富G发夹型捕获探针，G-rich hairpin DNA)，其序列如SEQ ID NO：2所示；其包含5’富G垂悬端和发夹型色氨酸适配体Trp3a-1区。

所述缓冲液Pi为磷酸氢二钠与磷酸二氢钠的混合液，pH为6.6(25℃)。

第六方面，本发明提供了一种基于前述的检测体系进行血浆色氨酸检测的方法，包括以下步骤：将前述血浆色氨酸的检测体系进行紫外照射20～30min，然后在490nm激发波长下进行荧光性能表征，即得检测结果。

所述血浆色氨酸检测反应的机制是：在紫外照射后，没有色氨酸时，AgNCs/ShC和HpG杂交体系CG荧光略微增强；而有色氨酸时，杂交体系CGT黄色荧光显著增强。

第七方面，本发明提供了一种基于前述的检测体系进行血浆白蛋白检测的方法，包括以下步骤：将前述血浆白蛋白的检测体系进行紫外照射20～30min，然后在490nm激发波长下进行荧光性能表征，即得检测结果。

所述血浆白蛋白检测反应的机制是：在紫外照射后，色氨酸与AgNCs/ShC和HpG杂交体系具有强黄色荧光，而白蛋白特异性结合在色氨酸上，导致荧光淬灭，且淬灭程度与白蛋白含量成正比。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

第一，该体系以适配体特异性捕获的色氨酸为核心，使其与DNA、银原子形成独特光化学反应基团，进而实现荧光银纳米团簇信号生成与色氨酸分子识别相统一，有效区分色氨酸荧光增强信号与其它荧光淬灭因子信号，提高色氨酸识别特异性。

第二，本检测无需对探针进行荧光发射团或淬灭因子标记，且无需进行热循环反应，只要将各成分直接混合，并将所得反应混合液紫外照射20～30min，即可在普通荧光酶标仪上进行结果读取，相比传统色氨酸检测方法，其反应时间短，且可避免使用大型仪器，具有可推广性或实现床边检测的潜力。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为色氨酸-AgNCs/DNA荧光增强效应示意图；

图2为实施例1进行的信号探针优化结果：图2A-D分别为以AgNCs/OC、AgNCs/Sh1C、AgNCs/Sh2C和AgNCs/Sh3C为信号探针，并以HpG为捕获探针时各反应混合液的荧光发射光谱(λ

图3为实施例2进行的捕获探针适配体序列依赖性考察结果：图3A为以AgNCs/Sh3C为信号探针，并分别以HpG、HpGSh1、HpGSh2和HpGSh3为捕获探针时各反应混合液的荧光发射峰值强度(λ

图4为实施例3测定的色氨酸-AgNCs/ShC检测体系和色氨酸-ShC对照体系的光化学反应特性：图4A和图4B分别为有或无AgNCs条件下各反应混合液的荧光发射光谱；图4C为各反应混合液的荧光发射峰值强度(λ

图5为实施例3监测的CG和CGT反应混合液的紫外照射时间依赖性结果：图5A为不同UV照射时间下CG和CGT的荧光发射峰值强度；图5B为不同UV照射时间下CGT相比CG的荧光强度增强值(λ

图6为实施例4中色氨酸-AgNCs/DNA检测体系的灵敏度表征结果(AgNCs/Sh3C为信号探针，HpG为捕获探针)：图6A为不同浓度色氨酸标准品的荧光发射光谱(λ

图7为实施例4中色氨酸-AgNCs/DNA检测体系的特异性表征结果(AgNCs/Sh3C为信号探针，HpG为捕获探针)：图7A为各检测体系的荧光峰值增强值(λ

图8是实施例4检测的血浆中生理浓度吲哚或5-羟基-L-色氨酸对色氨酸-AgNCs/DNA检测体系的影响结果(AgNCs/Sh3C为信号探针，HpG为捕获探针)：图8A为不同浓度吲哚与检测体系混合液的荧光峰值强度值；图8B为不同浓度5-羟基-L-色氨酸与检测体系混合液的荧光峰值强度值(λ

图9为实施例5中各检测体系直接混合反应和经过热循环反应方式的比较结果；

图10为实施例6中血浆主要成分NaCl对色氨酸-AgNCs/ShC光化学传感体系的影响结果(AgNCs/Sh3C为信号探针，HpG为捕获探针)：图10A为不含NaCl的色氨酸-AgNCs/ShC检测体系CGT的荧光发射光谱(λ

图11为实施例7中血浆HSA对色氨酸-AgNCs/ShC光化学传感体系的影响结果(AgNCs/Sh3C为信号探针，HpG为捕获探针)：图11A为含不同浓度HSA的CGT反应混合液的荧光发射光谱(λ

图12为实施例8中色氨酸-AgNCs/ShC光化学传感体系用于血浆HSA检测时的色氨酸回补浓度优化结果(AgNCs/Sh3C为信号探针，HpG为捕获探针)：图12A-图12C分别为CG回补终浓度0μM、50μM、100μM L-Trp时与未处理血浆样本的反应混合液的荧光发射峰值强度(λ

图13为实施例8中血浆样本白蛋白检测结果：图13A–图13C分别为CGT体系(AgNCs/Sh3C为信号探针，HpG为捕获探针，终浓度100μM L-Trp)对血浆样本进行HSA检测的荧光发射峰值强度、荧光峰值增强值及HSA浓度值(λ

图14为实施例9中色氨酸-AgNCs/ShC光化学传感体系用于血浆色氨酸检测时的血浆样本处理方式优化结果；图14A和图14B分别为CG体系(AgNCs/Sh3C为信号探针，HpG为捕获探针)对去蛋白血浆样本进行色氨酸检测的荧光发射峰值强度及荧光发射峰值增强值(λ

图15为实施例9中扩大样本量后的血浆样本色氨酸检测结果：图15A和图15C分别为CG体系(AgNCs/Sh3C为信号探针，HpG为捕获探针)对去蛋白血浆样本进行色氨酸检测的荧光发射峰值强度及荧光发射峰值增强值(λ

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明建立的色氨酸-AgNCs/DNA光化学传感体系，如图1所示；其中：①AgNCs/ShC信号探针制备，②HpG捕获探针与色氨酸结合，③信号探针与捕获探针杂交；在紫外照射一定时间后，没有色氨酸时，AgNCs/ShC和HpG杂交体系CG荧光略微增强；而有色氨酸时，杂交体系CGT黄色荧光显著增强。ShC：富C DNA序列；HpG：含富G垂悬端的发夹型DNA序列；AgNCs：银纳米团簇；Trp：色氨酸；Trp3a-1：色氨酸适配体序列。本申请所涉序列如下：

ShC或Sh3C(SEQ ID No.1)：cgtgccccttaatcccc

HpG(SEQ ID No.2)：gggtggggtggggtgggggcacgttggttaggtcaggtttgggtttcgtgc

OC(SEQ ID No.3)：gcacgaaacccaaacctgacctaaccaacgtgccccttaatcccc

Sh1C(SEQ ID No.4)：cctgacctaaccaacgtgccccttaatcccc

Sh2C(SEQ ID No.5)：taaccaacgtgccccttaatcccc

HpGSh1(SEQ ID No.6)：gggtggggtggggtgggggcacgttggttaggtcaggtttgggttt

HpGSh2(SEQ ID No.7)：gggtggggtggggtgggggcacgttggtta

HpGSh3(SEQ ID No.8)：gggtggggtggggtgggggcacg

上述的各序列均由本领域常规技术合成，具体由生工生物工程(上海)公司合成。

(1)反应液配置

首先进行信号探针优化。按照如下方法制备AgNCs/xC(x＝O,Sh1-3)：将等摩尔的AgNO

随后，按照1.2μL HpG(100μM)，1μL L-色氨酸(5mM)，1μL缓冲液Pi(200mM)，6.8μL无酶水，制备适配反应混合液，并于热循环仪上进行适配反应：95℃，5min；4℃，15min；25℃，35min；反应完成后，将其与40μL AgNCs/xC(3μM)混合，并于热循环仪上进行杂交反应：25℃，60min。最后，对所得反应液进行荧光性能表征。在凝胶成像系统2500Gel ImageSystem(Tanon)上采集紫外灯下的荧光灰度图，利用Cytation5荧光酶标仪(Biotek，美国)进行检测(激发波长λ

同时，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE实验。制备相应样本及其标准品的上样混合液和20％非变性聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel，PAGE)，上样10～15μL，在1×TBE(pH＝8.0)缓冲液中120V恒压下电泳～2h。

(2)结果

以HpG为捕获探针，构建与捕获探针互补序列长度不同的信号探针，分别配置信号探针AgNCs/xC，及其与色氨酸T和/或捕获探针HpG的反应混合液，寻找具备色氨酸荧光增强效应的信号探针序列。如图2所示，唯有以Sh3C为信号探针时，Sh3CT或Sh3CGT反应混合液分别较Sh3C或Sh3CG有荧光增强(图2A-图2E)。且后续经过化学计量比优化，当按1DNA:40AgNO

(1)反应液配置

接着进行捕获探针适配体序列依赖性考察。按照如下方法制备AgNCs/ShC：将等摩尔的AgNO

随后，按照1.2μL HpGx(100μM，x＝Sh1-3)，1μL L-色氨酸(5mM)，1μL缓冲液Pi(200mM)，6.8μL无酶水，制备适配反应混合液，并于热循环仪上进行适配反应：95℃，5min；4℃，15min；25℃，35mi；反应完成后，将其与40μL AgNCs/ShC(3μM)混合，并于热循环仪上进行杂交反应：25℃，60min。将所得反应液紫外照射20～30min后进行荧光性能表征。在凝胶成像系统2500Gel Image System(Tanon)上采集紫外灯下的荧光灰度图，利用Cytation 5荧光酶标仪(Biotek，美国)进行检测(激发波长λ

(2)结果

以Sh3C为信号探针，构建具有不同长度适配体序列的捕获探针HpGx(x＝Sh1-3)，分别配置信号探针AgNCs/ShC，及其与色氨酸T和/或捕获探针(HpG、HpGSh1、HpGSh2、HpGSh3)的反应混合液，探寻捕获探针中色氨酸适配体序列对检测体系的影响。由图3可知，随着适配体序列区长度缩短，捕获探针介导的色氨酸荧光增强效应也逐渐减弱，因此，本发明采用含全长色氨酸适配体区的HpG作为最终检测体系的捕获探针。

(1)反应液配置

首先按照实施例2中所述方法制备AgNCs/ShC并配置反应混合液。按照1.2μL HpG(100μM)，1μL L-色氨酸(5mM)，1μL缓冲液Pi(200mM)，6.8μL无酶水，40μL AgNCs/ShC(3μM)，配置含终浓度100μM L-色氨酸的色氨酸-AgNCs/ShC检测体系CGT；并以不加AgNO

随后，按照1.2μL HpG(100μM)，1μL L-色氨酸(2.5mM)，1μL缓冲液Pi(200mM)，6.8μL无酶水，40μL AgNCs/ShC(3μM)(1ShC：40AgNO

(2)结果

在仅有信号探针的溶液C(1μL缓冲液Pi(200mM)，9μL无酶水，40μL AgNCs/ShC(3μM))，或信号探针与色氨酸的混合液CT(1μL L-色氨酸(5mM)，1μL缓冲液Pi(200mM)，8μL无酶水，40μL AgNCs/ShC(3μM))，或信号探针与捕获探针杂交所得溶液CG(1.2μL HpG(100μM)，1μL缓冲液Pi(200mM)，7.8μL无酶水，40μL AgNCs/ShC(3μM))时，荧光信号极弱(图4A中的C、C+T、CG所示曲线)。仅所得色氨酸与杂交探针的CGT反应混合液(即步骤实施例2中配置的色氨酸-AgNCs/ShC检测体系)荧光信号最强，呈现490nm ex/560～570nm em处的特征荧光激发/发射对(图4A中的CGT所示曲线)，呈黄色荧光。同时，我们初步研究了其光化学反应特性，发现在该反应体系中，当不向ShC序列中加入AgNO

(1)反应液配置

按照实施例2中所述方法配置反应混合液。分别将1.2μL HpG(100μM)，1μL梯度浓度L-色氨酸(0～10mM原始浓度)标准品或特异性检测用小分子(2.5mM)标准品，1μL缓冲液Pi(200mM)，6.8μL无酶水和40μL AgNCs/ShC(3μM)混合进行反应，得到不同浓度L-色氨酸标准品(终浓度为0～200μM)的色氨酸-AgNCs/DNA检测体系。另外，分别制备含终浓度50μM特异性检测用小分子(包括L-色氨酸、芳香族氨基酸及其它氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸)、色氨酸代谢物及衍生物(犬尿氨酸、褪黑素、5-羟基-L-色氨酸、D-色氨酸和1-甲基-D-色氨酸)、吲哚及衍生物(吲哚和吲哚乙酸))、无机溶液(包括甲醇、乙醇、氢氧化钠和乙酸)的相应检测体系。将上述反应混合液紫外照射20～30min后，进行实施例2中所述荧光性能表征。

分别按照1.2μL HpG(100μM)，6μL含吲哚或5-羟基-L-色氨酸(0～5μM)的L-色氨酸溶液(0或50μM)，1μL缓冲液Pi(200mM)，1.8μL无酶水，40μL AgNCs/ShC(3μM)配置反应混合液，进行前述荧光性能表征。

(2)结果

我们对色氨酸-AgNCs/DNA光化学传感体系用于色氨酸检测的灵敏度和特异性进行了评估。结果显示该检测体系在色氨酸终浓度变化范围为0～200μM时，荧光发射峰值及其增强值与色氨酸浓度间呈两相关联拟合曲线(图6A、图6C和图6E)。在终浓度于0～60μM范围内，检测体系荧光发射峰值及其增强值分别满足线性拟合关系，检测灵敏度为0.05μM(图6B、图6D和图6E)。另外，特异性检测发现该体系可特异性识别色氨酸的吲哚基团。相比L-色氨酸的荧光增强，甘氨酸、L-酪氨酸和L-苯丙氨酸以及犬尿氨酸仅有极微弱信号，且5-羟基-L-色氨酸及褪黑素呈相反的荧光淬灭信号。采用一些无机溶液包括甲醇、乙醇、氢氧化钠和乙酸的检测体系也显示与L-色氨酸相反的荧光淬灭信号(图7A和图7B)。此外，通过引入生理浓度吲哚或5-羟基-L-色氨酸，模拟血浆样本检测所用CGT体系，发现在5μM以下荧光增强子吲哚或荧光淬灭子5-羟基-L-色氨酸作用下，色氨酸对CG体系依然表现为荧光增强信号(图8A和图8B)。加之，临床研究显示血浆色氨酸浓度为30～70μM，且血浆中吲哚及吲哚乙酸等干扰物质含量不足1μM，对色氨酸检测影响较小，因此，该体系可有效进行血浆色氨酸检测。

(1)反应液配置

用两种方式配置反应混合液，一份按照实施例2中所述热循环反应方法分别进行适配反应和杂交反应，一份按照直接混合法配置，即将1.2μL HpG(100μM)，1μL L-色氨酸(5mM)，1μL缓冲液Pi(200mM)，6.8μL无酶水和40μL AgNCs/ShC(3μM)直接混合。将所得反应液紫外照射20～30min后进行实施例2中所述荧光性能表征。

(2)结果

为了缩短反应时间，我们考察了色氨酸-AgNCs/DNA检测体系经过热循环反应或直接混合反应后是否会有差别。由图9可知，两种反应方式均呈现为CGT具有最高荧光发射峰值，即均具备富G序列介导的色氨酸荧光增强效应。令人惊喜的是，直接混合反应液相较热循环反应液具有较强荧光，表明本反应体系可以不经过热循环反应，而通过直接混合并紫外照射后生成相应检测信号，从而大大缩短反应时间，具备床边检测的潜力。

(1)反应液配置

分别按照1.2μL HpG(100μM)，1μL L-色氨酸(5mM)，1μLNaCl标准品(0～250mM)，1μL缓冲液Pi(200mM)，5.8μL无酶水和40μL AgNCs/ShC(3μM)，采用直接混合法，配置含不同生理浓度NaCl的色氨酸-AgNCs/DNA检测体系(CGT-NaCl)，并相应制备含不同生理浓度NaCl的仅含信号探针的反应混合液C-NaCl、信号探针与捕获探针杂交的反应混合液CG-NaCl、信号探针与色氨酸的反应混合液CT-NaCl，进行实施例2中所述荧光性能表征。

(2)结果

在仅有信号探针的反应液C或信号探针与捕获探针杂交所得反应混合液CG时，NaCl的加入对荧光没影响，而在向信号探针与色氨酸混合液CT中加入NaCl时，可显著提高其荧光(图10A-图10C)。值得注意的是，不同生理浓度NaCl对色氨酸与杂交探针反应混合液CGT荧光影响不大(图10D)，表明该体系在进行色氨酸检测时不受血浆中高浓度NaCl的干扰。

(1)反应液配置

分别按照1.2μL HpG(100μM)，0或1μL L-色氨酸(5mM)，1μL HSA标准品(0～5000μM)，1μL缓冲液Pi(200mM)，5.8μL无酶水和40μL AgNCs/ShC(3μM)，采用直接混合法，配置含不同生理浓度HSA的色氨酸-AgNCs/DNA检测体系，紫外照射20～30min后，进行实施例2中所述荧光性能表征。

(2)结果

如图11所示，在0～5000μM原始浓度(相应终浓度为0～100μM)HSA范围内，随着HSA浓度增高，信号探针与捕获探针杂交所得反应混合液CG以及色氨酸与杂交探针反应混合液CGT的荧光发射峰值强度呈指数下降(图11A-图11C)，且在0～1000μM原始浓度(相应终浓度为0～20μM)HSA范围内，两检测体系呈线性递减，且CGT递减幅度显著高于CG(图11D)。色氨酸对白蛋白的特异性结合作用，可能是白蛋白对CGT体系荧光淬灭效应的原因。利用该效应，可实现基于CGT体系的血浆白蛋白联合检测。

(1)反应液配置

首先，分别取3例脓毒症(Sepsis)、3例系统性炎症反应综合征(SIRS)、3例其它轻微症状(Others)和2例正常志愿者(Nomal)血浆样本，按照1.2μL HpG(100μM)，1μL L-色氨酸(0,2.5mM或5mM)，1μL血浆样本，1μL缓冲液Pi(200mM)，5.8μL无酶水和40μL AgNCs/ShC(3μM)，采用直接混合法，配置反应混合液，紫外照射20min后，进行前述荧光性能表征。

随后，分别取15例脓毒症(Sepsis)、10例系统性炎症反应综合征(SIRS)、8例其它轻微症状(Others)和7例正常志愿者(Normal)血浆样本，按照1.2μL HpG(100μM)，1μL L-色氨酸(5mM)，1μL血浆样本或白蛋白HSA标准品(0～1000μM)，1μL缓冲液Pi(200mM)，5.8μL无酶水和40μL AgNCs/ShC(3μM)，采用直接混合法，配置反应混合液，紫外照射20～30min后，进行前述荧光性能表征。

(2)结果

首先，通过向色氨酸-AgNCs/DNA体系中回补不同浓度色氨酸(0μM、50μM和100μM)，寻找最优的可用于血浆HSA检测的色氨酸-AgNCs/DNA体系。如图12所示，在不加色氨酸，即仅由信号探针与捕获探针杂交所得CG体系用于检测血浆样本时，其无法区分四组样本间差异(图12A)。在由含终浓度50或100μM色氨酸与杂交探针所得CGT体系用于检测血浆样本时，其可以区分脓毒症组与正常组间差异，而且后者还可以区分脓毒症与SIRS组间差异(图12B-图12C)。因此，我们采用回补终浓度100μM色氨酸与杂交探针所得CGT体系作为血浆白蛋白检测体系。

随后，利用HSA对色氨酸-AgNCs/DNA体系的荧光淬灭效应，进行血浆样本检测，发现从脓毒症(Sepsis)、SIRS、其它轻微症状(Others)到正常志愿者(Normal)，其HSA检测荧光发射峰值依序递减(图13A)，荧光发射峰值降低值依序递增(图13C)，换算所得HSA浓度依序递增(图13B)。基于本发明中方法的HSA检测结果与临床血常规检测结果一致(图13D)，说明该反应体系可用于血浆HSA检测。

(1)反应液配置

首先，对3例脓毒症(Sepsis)、3例系统性炎症反应综合征(SIRS)、3例其他(她)轻微症状(Others)、3例正常志愿者(Nomal)分别各取两份25μL血浆样本，一份中直接加入75μL乙腈：甲醇＝1:1混合液，涡旋震荡30s；最后，12000rpm，4℃，15min，离心，进行去蛋白处理，收集上层清液得到处理后血浆样本；另一份先加入0.25μL 10mM月桂酸钠储备液，于37℃水浴2h，随后，再加入75μL乙腈：甲醇＝1:1的有机混合液，涡旋震荡30s；最后，12000rpm，4℃，15min，离心，进行去蛋白处理，收集上层清液得到处理后血浆样本。按照1.2μL HpG(100μM)，6μL处理后血浆样本，1μL缓冲液Pi(200mM)，1.8μL无酶水和40μL AgNCs/ShC(3μM)，采用直接混合法，配置反应混合液，紫外照射20～30min后，进行前述荧光性能表征。随后扩大样本量，分别取15例脓毒症(Sepsis)、10例系统性炎症反应综合征(SIRS)、8例其它轻微症状(Others)和7例正常志愿者(Normal)血浆样本，采用前述相同方法进行血浆样本处理及血浆色氨酸检测。

另外，借助LC-MS对上述同样处理的样本进行色氨酸检测。采用如下色谱质谱条件，进行色氨酸检测。色谱柱：美国Waters UPLC BEH C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)；流动相：A：水(含0.1％甲酸的水溶液)；B：乙腈；流速：0.35mL/min；柱温：40℃；进样量：5μL。质谱条件：电喷雾电离源(ESI)，正离子扫描，源喷射电压：5500V，温度：550℃，碰撞气Medium，气帘气40psi，离子源气体1为50psi，离子源气体2为60psi。扫描方式为MRM，入口电压EP：10，碰撞池出口电压CXP：18。色氨酸m/z 205.2→146.1，碰撞能量(CE)23V，去簇电压(DP)为40V，四级杆捕捉时间100ms；内标色氨酸-d5 m/z 210.2→150.2，碰撞能量(CE)20V，去簇电压(DP)为70V，四级杆捕捉时间100ms。在确定了实验条件后，按照传统液相色谱串联质谱LC-MS实验方法，绘制标准曲线，并进行血浆样本检测。

(2)结果

无论去蛋白处理血浆样本，还是月桂酸钠处理后去蛋白血浆样本，利用色氨酸-AgNCs/DNA体系检测色氨酸时，均显示正常人中荧光增强程度最高(图14A，图14B，图14D和图14E)，提示正常血浆中色氨酸浓度最高，与LC-MS检测结果一致(图14C和图14F)。值得注意的是，月桂酸钠处理后的去蛋白血浆样本，脓毒症血浆色氨酸低于正常对照组，且具有统计学意义(图14D和图14E)。同时，相比仅去蛋白处理样本，额外增加的月桂酸钠处理可以使色氨酸检测浓度升高约5～10μM(图14C和图14F)，与月桂酸钠处理可以促使释放白蛋白上结合的色氨酸这一现象一致。综上可见，月桂酸钠处理有助于更好地检测血浆色氨酸。

再进一步扩大样本量后继续进行血浆色氨酸检测，如图15所示，在去蛋白处理(图15A和图15C)以及月桂酸钠兼去蛋白处理(图15B和图15D)后，均显示正常志愿者较脓毒症患者血浆有较高荧光信号，暗示前者较后者具有更高浓度色氨酸。

本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海市公共卫生临床中心

<120> 基于DNA合成银纳米团簇与色氨酸光化学反应的血浆色氨酸和白蛋白联合检测方法

<130> SHX1372

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgtgcccctt aatcccc 17

<210> 2

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gggtggggtg gggtgggggc acgttggtta ggtcaggttt gggtttcgtg c 51

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcacgaaacc caaacctgac ctaaccaacg tgccccttaa tcccc 45

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cctgacctaa ccaacgtgcc ccttaatccc c 31

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taaccaacgt gccccttaat cccc 24

<210> 6

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gggtggggtg gggtgggggc acgttggtta ggtcaggttt gggttt 46

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gggtggggtg gggtgggggc acgttggtta 30

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gggtggggtg gggtgggggc acg 23