一种用于分离捕获尤文肉瘤循环肿瘤细胞的芯片

摘要

一种用于分离捕获尤文肉瘤循环肿瘤细胞的芯片，本发明提供一种微流控芯片用于从外周血中分离捕获尤文肉瘤循环肿瘤细胞，通过免疫荧光试剂对捕获的细胞进行标记，进而通过荧光显微镜对捕获的细胞进行鉴定。本发明的有益效果如下：1)、按临界分选尺寸排列的微流控多组微柱阵列结构能够避免滤膜的堵塞问题。2）、尤文肉瘤CTC的表面抗原能与CD99抗体在芯片捕获区内发生特异性抗原‑抗体结合，鱼骨结构使流体产生涡旋，增加CTC被抗体捕获的能力。3）、血液样本不需要红细胞裂解和密度梯度离心等影响细胞活性的前处理操作，且细胞在微柱阵列和鱼骨凹槽内所受的剪切力较小，因此能很好的保持细胞的活性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种微流控芯片，具体来说，涉及一种用于分离捕获尤文肉瘤循环肿瘤细胞的芯片。

背景技术

尤文肉瘤（Ewing sarcoma, ES）是一种少见的小圆细胞恶性肿瘤，属于尤文氏肉瘤家族肿瘤。它占所有原发性骨肿瘤的6%～8%，是儿童和青少年最常见的恶性原发性骨肿瘤。这类肿瘤恶性程度高、易复发、预后差。发生部位常在骨盆、胸壁和腿，但也可能发生在身体的其它部位。临床表现主要是局部疼痛、肿胀，也可伴有发烧、乏力和消瘦，影像学检查显示肿瘤呈溶骨性虫蚀样破坏，骨膜反应为“放射状”或“洋葱皮”样。组织活检为诊断的重要依据，影像学有助于判断肿瘤的分期和预后。大约20%-25%的患者在确认时就已经出现转移，转移部位多见于肺、骨髓以及颅内。目前，尤文肉瘤的组织学起源尚不清楚，但通常认为其起源于骨髓间充质干细胞。EWSR1-FLI1融合基因存在于90％的尤文肉瘤患者中，这是尤文肉瘤的特征。另一个特征是细胞表面高度表达糖蛋白MIC2（CD99），因此MIC2的表达可用于辅助鉴别诊断小圆形细胞肿瘤。

组织活检存在给患者带来很大痛苦、不能频繁操作、只能对单一器官进行检测、容易激发癌细胞快速增长等许多局限。而液体活检不仅可以大幅缩短癌症确认时间，而且可以对癌症患者的治疗情况进行随时跟踪，真正实现“个性化精准治疗”。循环肿瘤细胞（CTC）是近年来研究应用的几个新型肿瘤分子标志物之一。通过检测CTC数量和蛋白表达可对肿瘤进行确诊、判断预后、监控疗效。例如，当CTC出现上皮间质转换（EMT）、过表达上皮细胞粘附分子往往提示肿瘤患者预后不佳；通过对比手术或放化疗前后血液中CTC数量，可以判断治疗是否有效，具有重要的临床研究及应用价值。

发明内容

本发明提供一种微流控芯片用于从外周血中分离捕获尤文肉瘤循环肿瘤细胞，通过免疫荧光试剂对捕获的细胞进行标记，进而通过荧光显微镜对捕获的细胞进行鉴定。

一种用于分离捕获尤文肉瘤循环肿瘤细胞的芯片，其特征在于，所述的芯片包括有血液入口、用于去除大部分血细胞的第一级富集区、位于所述的第一级富集区下游并与之相连通的用于捕获尤文肉瘤CTC的第二级捕获区和废血出口；所述的第一级富集区和第二级捕获区由玻璃基底和设于玻璃基底上方的聚合物层组成，所述的第一级富集区内设有三组或三组以上的串联的富集微柱阵列结构，所述的第二级捕获区的玻璃基底上修饰有特异性捕获尤文肉瘤CTC的CD99抗体，第二级捕获区的聚合物层上设有V字形鱼骨凹槽结构；所述的V字形鱼骨凹槽结构和玻璃基底之间形成有流体通道。

血液从细胞富集区的血液入口进入，首先经第一级富集区中的第一组微柱阵列结构的分选，小尺寸的红细胞、白细胞和血小板等不受阵列临界尺寸的影响，顺着流体方向进入废血通道流向废血出口；大尺寸的肿瘤细胞和部分白细胞则受到微柱阵列临界尺寸偏移的作用，沿着阵列偏移的方向汇集于中间的富集通道内，流向下一组微柱阵列结构，进行二次富集；在第二组微柱阵列结构中，从上一组富集通道过来的细胞继续按临界尺寸进行分选，小尺寸的细胞继续流向废血出口，大尺寸的细胞继续汇集于第二组微柱阵列结构的中间通道内，流向第三组微柱阵列结构；优选的是经过三组所述微柱阵列结构的分选富集，每组微柱阵列的临界尺寸和偏移角度可以相同，也可以依次递增，经多组串联微柱阵列的依次分选，使得废血细胞得到进一步的排除，提高了肿瘤细胞的分选纯度，富集通道最终流向第二级捕获区。在第二级捕获区中进行尤文肉瘤CTC的原位捕获，由于玻璃基底上修饰有特异性结合尤文肉瘤CTC的CD99抗体，因此可以对尤文肉瘤CTC进行特异性捕获，所述的第二级捕获区的聚合物层上设为V字形鱼骨凹槽结构，可以将流经其内的血液流体产生涡旋，从而打破血液在芯片内的层流，增加抗体与细胞的接触机会和结合力，提高CTC的捕获效率。

作为优选的，所述的微柱阵列结构为圆柱形或三角形。

作为优选的，所述的第一级富集区的微柱阵列结构中设有用于富集肿瘤细胞的富集通道，富集通道位于所述的每组微柱阵列结构的中心位置，微柱阵列的分布以所述的富集通道为中心轴对称排列。

作为优选的，所述的微柱阵列结构末端对称的设有第一级废血出口，所述的第一级废血出口优选设有两个，分别对称的设置在微柱阵列结构的两侧；第二级捕获区末端也设有第二级废血出口。

作为优选的，所述的微柱阵列结构中的圆柱形或三角形微柱的直径或边长在10-30微米之间，两个相邻微柱之间的行间距为20-30微米，列间距为30-50微米，高度为30-40微米，阵列偏移角度为1-30度。

作为优选的，每组所述的V字形鱼骨凹槽结构包括有8条平行微通道组成。

进一步的，V字形鱼骨凹槽宽度为30微米，高度为20微米，两鱼骨槽的间距为50微米，通道的深度为40微米，鱼骨的夹角为90度，鱼骨与芯片边沿的夹角为45度。

进一步的，所述的V字形鱼骨凹槽结构呈周期性交错排列。

作为优选的，所述的V字形鱼骨凹槽结构和玻璃基底之间设有流体通道。

作为优选的，所述的第二级捕获结构的玻璃基底表面先用3-巯基丙基三甲氧基硅烷和N-马来酰亚胺基丁酰氧基琥珀酰亚胺酯处理；然后将表面掺入抗生蛋白链菌素；最后嫁接CD99抗体。

本发明的有益效果如下：能够同时实现高效率、高纯度、高活性的从待处理的血液中分离捕获尤文肉瘤CTC，并同时实现将目标细胞原位捕获在芯片中。具体如下：1)、按临界分选尺寸排列的微流控多组微柱阵列结构能够避免滤膜的堵塞问题，在每组阵列内大尺寸细胞沿着偏移方向富集于中间通道，小尺寸细胞则沿着流体方向流向废血出口，多组串联结构提高了富集效率和纯度。2）、尤文肉瘤CTC的表面抗原能与CD99抗体在芯片捕获区内发生特异性抗原-抗体结合，鱼骨结构使流体产生涡旋，增加CTC被抗体捕获的能力。3）、血液样本不需要红细胞裂解和密度梯度离心等影响细胞活性的前处理操作，且细胞在微柱阵列和鱼骨凹槽内所受的剪切力较小，因此能很好的保持细胞的活性。

附图说明

图1为本发明的一种用于分离捕获尤文肉瘤细胞的芯片示意图；

图2为本发明第二级捕获区的截面图；

图3为本发明的V字形鱼骨凹槽结构示意图；

图4具体实施例中的捕获效率线条图。

具体实施方式

请参照图1，一种用于分离捕获尤文肉瘤细胞的芯片，所述的芯片包括有第一级富集区（1）和位于所述的第一级富集区（1）下游并与之相连通的第二级捕获区（2）；所述的第一级富集区（1）包括有三组或三组以上的按细胞临界尺寸排列的微柱阵列结构（11），图1中显示是三组微柱阵列结构（11），所述的微柱阵列结构（11）包括有设于首端的细胞富集区血液入口、位于微柱阵列结构内的富集通道（31）和位于通向微柱阵列结构尾端废血出口的废血通道（32），由于每组微柱阵列结构（11）是相连通的，因此位于上一组的微柱阵列结构（11）的富集通道的出口（31）直接连接到下一组微柱阵列结构（11）的入口；如图2所示，所述的第二级捕获区（2）的玻璃基底（21）上修饰有特异性捕获尤文肉瘤CTC的CD99抗体（23），聚合物层（22）上设有多组周期性排列的V字形鱼骨凹槽结构（24），所述的V字形鱼骨凹槽结构（24）和玻璃基底（21）之间形成有40微米高度的流体通道。

血液从血液入口进入，经第一级富集区（1）中的第一组微柱阵列结构（11）的分选，小尺寸的红细胞、白细胞和血小板等由于不受阵列临界尺寸的影响，顺着流体方向经废血通道流向废血出口；大尺寸的肿瘤细胞和部分白细胞则受到微柱阵列临界尺寸的阻挡作用，沿着阵列偏移的方向汇集于中间的富集通道内，流向下一组微柱阵列结构（11），进行二次富集；在第二组微柱阵列结构中，从上一组富集通道过来的细胞继续按临界尺寸进行分选，小尺寸的细胞继续流向废血出口，大尺寸的细胞继续汇集于第二组微柱阵列结构的中间通道内，流向第三组微柱阵列结构；如图1中所示，经过三组所述微柱阵列结构（11）的分选富集，使得肿瘤细胞的富集纯度进一步提高，富集完毕后流向第二级捕获区（2）。在第二级捕获区（2）中进行尤文肉瘤CTC的捕获，由于玻璃基底上修饰有特异性结合尤文肉瘤CTC的CD99抗体（23），因此可以对尤文肉瘤CTC进行特异性捕获，所述的聚合物层（22）上的V字形鱼骨凹槽结构（24）可以将流经其内的血液流体产生涡旋，打破血液在芯片内的层流，增加尤文肉瘤CTC与CD99抗体的接触机会和结合力，提高CTC捕获效率。

所述的微柱阵列结构（11）为圆柱形结构。

所述的血液富集通道（31）位于所述的微柱阵列结构的中心位置，所述的微柱阵列以所述的富集通道为中心轴对称排列。

所述的微柱阵列结构尾端对称的设有两个第一级废血出口(32)。第二级捕获区末端也设有第二级废血出口。

所述的第一级捕获区的微柱阵列结构中的微柱为圆柱形或三角形，所述的微柱的直径或边长在10-30微米之间，两相邻微柱之间的行间距为20-30微米，列间距为30-50微米，微柱高度为30-40微米，微柱阵列向中间富集通道的偏移角度为1-30度，三组串联结构组成的富集区的上述参数可以相同，也可以逐级以1-10%的比例递增。V字形鱼骨凹槽结构（24）的平面图如图3所示，所述的每组V字形鱼骨凹槽结构包括有8条平行微通道组成。

V字形鱼骨凹槽宽度为W1为30微米，高度H1为20微米，两鱼骨槽的间距G1为50微米，V字形鱼骨凹槽结构（24）和玻璃基底（21）之间形成的流体通道的深度为40微米，鱼骨的夹角γ为90度，鱼骨与芯片边沿的夹角α为45度。

所述的V字形鱼骨凹槽结构（24）呈周期性交错排列，该周期性的排列如图1所示，每8个鱼骨为一组，所述V字形鱼骨凹槽结构与玻璃基底之间的微通道可以使流体产生涡旋，增加CTC与抗体的捕获效率。

所述的V字形鱼骨凹槽结构（24）和玻璃基底（21）之间设有流体通道，深度为40微米。

制作聚合物层的材质可以是聚二甲基硅氧烷（PDMS），也可以是聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚氨酯等。

操作时，将外周血以6ml/h的流速从血液入口处通入芯片，经过第一级富集区的富集，废血从废血出口流出，大尺寸的富集液细胞进入第二级捕获区，在该捕获区中，血液中的尤文肉瘤CTC与芯片表面修饰的CD99抗体发生细胞表面的特异性抗原-抗体结合，被原位捕获在芯片中，而其余血细胞则随着持续通入的流体被冲出芯片。细胞捕获之后，分别进行如下步骤：

1）通入PBS溶液洗涤；

2）通入4%多聚甲醛溶液进行固定并用PBS洗涤；

3）通入0.2% Triton X-100溶液进行通透并用PBS洗涤；

4）通入4% BSA溶液封闭60min并用PBS洗涤;

5）加入尤文肉瘤CTC特异性抗体；

6）避光过夜后用PBS洗涤；

7）在荧光显微镜下对芯片进行观测，判断其是否有捕获尤文肉瘤CTC及抗体的表达情况。

捕获效率验证

共进行5组，每组3次的实验，每次实验模拟样品约5毫升血液(即非目标细胞主要为血液中的白细胞和红细胞)，作为目标细胞的尤文肉瘤细胞系RD-ES直接加入到血液中，尤文肉瘤细胞浓度约每毫升100个，5组实验通量分别为6mL/h、9mL/h、12mL/h、15mL/h和18mL/h，经芯片分选，观察并计数细胞捕获区捕获的细胞量，进而分析捕获效率，每组取3次结果平均后，捕获效率如图4所示。