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2022-07-05
授权
发明专利权授予
技术领域
本发明涉及载药系统技术领域，更具体地，涉及一种水溶性二甲基姜黄素前药纳米粒、纳米制剂及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是当今社会威胁人类健康的重要疾病。当前的肿瘤临床治疗药物仍存在诸多缺陷，如发挥抗肿瘤作用时对正常细胞也会产生较大的毒性，易产生多药耐药现象，不能有效预防癌细胞的转移，临床复发率高，化学毒性大等。与传统药物相比，纳米药物可以增强药物溶解速率，稳定药效，增强药物作用靶向性，减少药物对正常组织的毒副作用，在药剂学中纳米药物的研究与开发利用已成为热点。
姜黄素的药用历史悠久，药理活性广泛，但溶解度低，代谢不稳定，生物利用度差。二甲基姜黄素(dimethoxycurcumin，DMC)是姜黄素的一种亲脂性结构类似物，它是在姜黄素的分子结构式上用甲氧基同时取代两侧苯环的羟基，消除了姜黄素苯环上潜在氧化部位酚羟基，大量研究结果表明：DMC可以通过多途径发挥药效，对多种肿瘤细胞增殖抑制的活性较姜黄素更强，在诸多疾病模型上显示明显强于姜黄素的治疗潜力。但是二甲基姜黄素存在水溶性极差、生物利用度低等问题，严重限制了其应用。
亲水性聚合物聚乙二醇(PEG)是应用最广泛且得到FDA批准可用于人体的微粒表面修饰材料，通过具有pH响应性化学键将PEG和药物结合起来，可提高药物生物利用度和靶向富集，并在病灶部位的特殊pH环境下靶向释放药物，减少对其他正常组织的毒副作用。但是如何将二甲基姜黄素有效地与PEG载体通过pH响应性化学键结合，从而提高二甲基姜黄素的水溶性和生物利用度，进一步提高抗肿瘤活性还未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的，提供了一种水溶性二甲基姜黄素前药纳米粒。该二甲基姜黄素前药纳米粒为甲氧基聚乙二醇醛基和二甲基姜黄素通过与水合肼共价偶联形成的化合物。
本发明的第二个目的，提供了一种二甲基姜黄素前药纳米粒的制备方法，包括：
(1)制备二甲基姜黄素衍生物：将二甲基姜黄素(DMC)和水合肼在溶剂中直接加热反应得到二甲基姜黄素衍生物。所形成的二甲基姜黄素衍生物可以用DMC＝N-NH
在本发明的优选实施方式中，制备方法具体为：将二甲基姜黄素溶于溶剂，再加入水合肼，在氮气保护下加热反应，反应结束后，旋蒸除去溶剂，-80℃冷冻2小时，移至冷冻干燥机避光冻干，得二甲基姜黄素衍生物；
其中，二甲基姜黄素和水合肼的摩尔比为1:1～1:10。
加热反应的温度为25～80℃。
加热反应的时间为12～48小时。
溶剂为无水甲醇或无水乙醇。
(2)制备二甲基姜黄素前药纳米粒：将步骤(1)制备的二甲基姜黄素衍生物和甲氧基聚乙二醇醛基(mPEG-CHO)反应得到二甲基姜黄素前药纳米粒。所形成的二甲基姜黄素前药纳米粒可以用mPEG-CH＝N-N＝DMC表示。
在本发明的优选实施方式中，具体制备方法为：将步骤(1)制备的二甲基姜黄素衍生物和甲氧基聚乙二醇醛基溶于溶剂，加热反应，反应结束后，将溶剂旋蒸除去，加入蒸馏水使之溶解，移至截留分子量为3500Da的透析袋中，在水中透析，透析结束后，透析液离心，取上清液，-80℃冷冻2h，移至冷冻干燥机中冻干，得到二甲基姜黄素前药纳米粒。
其中，甲氧基聚乙二醇醛基的平均分子量为1kDa～20kDa；
甲氧基聚乙二醇醛基与二甲基姜黄素衍生物的摩尔比为1:1～1:10。
加热反应的温度为25～80℃。
加热反应的时间为12～48小时。
所述溶剂为无水甲醇或无水乙醇。
所述透析处理时间为48～96小时。
本发明制备二甲基姜黄素前药纳米粒的具体合成路线如附图1所示。
将所述二甲基姜黄素与水合肼直接加热反应生成具有式(I)所示的二甲基姜黄素衍生物(DMC＝N-NH
将二甲基姜黄素衍生物与甲氧基聚乙二醇醛基直接加热反应生成具有式(Ⅱ)结构的二甲基姜黄素前药(mPEG-CH＝N-N＝DMC)。
本发明提供的二甲基姜黄素前药纳米粒可以以很高的包封率和载药量负载游离二甲基姜黄素，负载有游离二甲基姜黄素的纳米制剂具有pH敏感性释药的性质，具有强的肿瘤细胞杀伤作用。
本发明的第三个目的，提供了上述二甲基姜黄素前药纳米粒用于制备水溶性二甲基姜黄素纳米制剂的制备方法，即通过薄膜水化法制备负载有游离二甲基姜黄素的纳米制剂。
在本发明的优选实施方式中，具体制备方法为：
将二甲基姜黄素前药纳米粒和游离二甲基姜黄素加入溶剂中，在室温下搅拌溶解，旋蒸去除溶剂并成膜，加入超纯水，超声分散，离心取上清液，冷冻干燥后得到负载有游离二甲基姜黄素的纳米制剂。
二甲基姜黄素前药纳米粒与二甲基姜黄素的质量比为1:0～1:0.3；
搅拌时间为2～5小时；
溶剂为无水甲醇或无水乙醇；
上清液-80℃冷冻2小时，移至冷冻干燥机中避光冻干，可得到所述负载有游离二甲基姜黄素的纳米制剂。
本发明方法制备的前药纳米粒或纳米制剂在抗前列腺癌和肝癌中的应用。
总体而言，通过本发明的技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
(1)本发明将二甲基姜黄素和甲氧基聚乙二醇醛基通过腙键偶联。该化合物在超纯水中可以自组装成纳米粒，并可以以高的包封率和载药量负载游离二甲基姜黄素。
(2)本发明提供的负载有游离二甲基姜黄素的纳米制剂具有pH敏感性释药的性质，在肿瘤细胞内偏酸的微环境中，能够促使负载的药物释放。
(3)本发明提供的负载有游离二甲基姜黄素的纳米制剂具有良好的生物相容性，对肿瘤细胞的杀伤作用强于游离二甲基姜黄素。
附图说明
图1为本发明式(Ⅱ)化合物的合成路线图；
图2为本发明实施例1制备的二甲基姜黄素前药的核磁共振氢谱图；
图3为本发明实施例1制备的二甲基姜黄素前药的红外光谱图；
图4为本发明实施例1制备的二甲基姜黄素前药在超纯水中自组装成纳米粒的粒径分布图；
图5为本发明实施例1制备的二甲基姜黄素前药在超纯水中自组装成纳米粒的电镜图；
图6为本发明试验例3中制备的负载有游离二甲基姜黄素的前药纳米粒的药物释放图；
图7为本发明实施例3中制备的负载有游离二甲基姜黄素的前药纳米粒的肿瘤细胞杀伤效果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供了一种二甲基姜黄素前药，包括如下步骤：
(1)将二甲基姜黄素48mg(0.12mmol)溶于3mL甲醇，加入水合肼16.5mg(0.33mmol)，在氮气保护下，避光50℃搅拌反应24小时，得到反应液A；
(2)将步骤(1)获得的反应液A旋蒸，除去溶剂，移至冷冻干燥机避光冻干，得到的深黄色固体为二甲基姜黄素衍生物；
(3)将步骤(2)获得的二甲基姜黄素衍生物溶于3mL甲醇，加入甲氧基聚乙二醇醛基200mg(0.10mmol)，避光50℃搅拌反应24小时，得到反应液B；
(4)将步骤(3)获得的反应液B旋蒸，除去溶剂，加入6mL超纯水溶解，用超纯水透析3天，其中透析袋的截留分子量为3500Da，透析结束后，-80℃冰箱冷冻2小时，移至冷冻干燥机避光冻干，得到的深黄色固体为二甲基姜黄素前药纳米粒(164.5mg，产率：80.8％)。
实施例2
本实施例提供了一种二甲基姜黄素前药，包括如下步骤：
(1)将二甲基姜黄素48mg(0.12mmol)溶于3mL甲醇，加入水合肼7.2mg(0.12mmol)，在氮气保护下，避光50℃搅拌反应24小时，得到反应液A；
(2)将步骤(1)获得的反应液A旋蒸，除去溶剂，移至冷冻干燥机避光冻干，得到的深黄色固体为二甲基姜黄素衍生物；
(3)将步骤(2)获得的二甲基姜黄素衍生物溶于3mL甲醇，加入甲氧基聚乙二醇醛基200mg(0.10mmol)，避光50℃搅拌反应24小时，得到反应液B；
(4)将步骤(3)获得的反应液B旋蒸，除去溶剂，加入6mL超纯水溶解，用超纯水透析3天，其中透析袋的截留分子量为3500Da，透析结束后，-80℃冰箱冷冻2小时，移至冷冻干燥机避光冻干，得到的深黄色固体为二甲基姜黄素前药(145.3mg，产率：71.4％)。
实施例3
本实施例提供了一种二甲基姜黄素前药，包括如下步骤：
(1)将二甲基姜黄素48mg(0.12mmol)溶于3mL甲醇，加入水合肼7.2mg(0.60mmol)，在氮气保护下，避光50℃搅拌反应24小时，得到反应液A；
(2)将步骤(1)获得的反应液A旋蒸，除去溶剂，移至冷冻干燥机避光冻干，得到的深黄色固体为二甲基姜黄素衍生物；
(3)将步骤(2)获得的二甲基姜黄素衍生物溶于3mL甲醇，加入甲氧基聚乙二醇醛基200mg(0.10mmol)，避光50℃搅拌反应24小时，得到反应液B；
(4)将步骤(3)获得的反应液B旋蒸，除去溶剂，加入6mL超纯水溶解，用超纯水透析3天，其中透析袋的截留分子量为3500Da，透析结束后，-80℃冰箱冷冻2小时，移至冷冻干燥机避光冻干，得到的深黄色固体为二甲基姜黄素前药(153.3mg，产率：75.3％)。
实施例4
本实施例提供了一种二甲基姜黄素前药，包括如下步骤：
(1)将二甲基姜黄素48mg(0.12mmol)溶于3mL甲醇，加入水合肼7.2mg(1.20mmol)，在氮气保护下，避光50℃搅拌反应24小时，得到反应液A；
(2)将步骤(1)获得的反应液A旋蒸，除去溶剂，移至冷冻干燥机避光冻干，得到的深黄色固体为二甲基姜黄素衍生物；
(3)将步骤(2)获得的二甲基姜黄素衍生物溶于3mL甲醇，加入甲氧基聚乙二醇醛基200mg(0.10mmol)，避光50℃搅拌反应24小时，得到反应液B；
(4)将步骤(3)获得的反应液B旋蒸，除去溶剂，加入6mL超纯水溶解，用超纯水透析3天，其中透析袋的截留分子量为3500Da，透析结束后，-80℃冰箱冷冻2小时，移至冷冻干燥机避光冻干，得到的深黄色固体为二甲基姜黄素前药(156.3mg，产率：76.8％)。
实施例5
本实施例提供了一种二甲基姜黄素前药，包括如下步骤：
步骤(1)～(2)和实施例1相同。
(3)将步骤(2)获得的二甲基姜黄素衍生物溶于3mL甲醇，加入甲氧基聚乙二醇醛基240mg(0.12mmol)，避光50℃搅拌反应24小时，得到反应液B；
(4)将步骤(3)获得的反应液B旋蒸，除去溶剂，加入6mL超纯水溶解，用超纯水透析3天，其中透析袋的截留分子量为3500Da，透析结束后，-80℃冰箱冷冻2小时，移至冷冻干燥机避光冻干，得到的深黄色固体为二甲基姜黄素前药(188.0mg，产率：66.2％)。
实施例6
本实施例提供了一种二甲基姜黄素前药，包括如下步骤：
步骤(1)～(2)和实施例1相同。
(3)将步骤(2)获得的二甲基姜黄素衍生物溶于3mL甲醇，加入甲氧基聚乙二醇醛基48mg(0.024mmol)，避光50℃搅拌反应24小时，得到反应液B；
(4)将步骤(3)获得的反应液B旋蒸，除去溶剂，加入6mL超纯水溶解，用超纯水透析3天，其中透析袋的截留分子量为3500Da，透析结束后，-80℃冰箱冷冻2小时，移至冷冻干燥机避光冻干，得到的深黄色固体为二甲基姜黄素前药(36.2mg，产率：74.0％)。
实施例7
本实施例提供了一种二甲基姜黄素前药，包括如下步骤：
步骤(1)～(2)和实施例1相同。
(3)将步骤(2)获得的二甲基姜黄素衍生物溶于3mL甲醇，加入甲氧基聚乙二醇醛基24mg(0.012mmol)，避光50℃搅拌反应24小时，得到反应液B；
(4)将步骤(3)获得的反应液B旋蒸，除去溶剂，加入6mL超纯水溶解，用超纯水透析3天，其中透析袋的截留分子量为3500Da，透析结束后，-80℃冰箱冷冻2小时，移至冷冻干燥机避光冻干，得到的深黄色固体为二甲基姜黄素前药(10.6mg，产率：43.5％)。
实施例8
本实施例提供了一种二甲基姜黄素前药，包括如下步骤：
(1)将二甲基姜黄素48mg(0.12mmol)溶于3mL甲醇，加入水合肼16.5mg(0.33mmol)，在氮气保护下，避光25℃搅拌反应24小时，得到反应液A；
(2)将步骤(1)获得的反应液A旋蒸，除去溶剂，移至冷冻干燥机避光冻干，得到的深黄色固体为二甲基姜黄素衍生物；
(3)将步骤(2)获得的二甲基姜黄素衍生物溶于3mL甲醇，加入甲氧基聚乙二醇醛基200mg(0.10mmol)，避光25℃搅拌反应24小时，得到反应液B；
(4)将步骤(3)获得的反应液B旋蒸，除去溶剂，加入6mL超纯水溶解，用超纯水透析3天，其中透析袋的截留分子量为3500Da，透析结束后，-80℃冰箱冷冻2小时，移至冷冻干燥机避光冻干，得到的深黄色固体为二甲基姜黄素前药(124.4mg，产率：61.1％)。
实施例9
本实施例提供了一种二甲基姜黄素前药，包括如下步骤：
(1)将二甲基姜黄素48mg(0.12mmol)溶于3mL乙醇，加入水合肼16.5mg(0.33mmol)，在氮气保护下，避光80℃搅拌反应24小时，得到反应液A；
(2)将步骤(1)获得的反应液A旋蒸，除去溶剂，移至冷冻干燥机避光冻干，得到的深黄色固体为二甲基姜黄素衍生物；
(3)将步骤(2)获得的二甲基姜黄素衍生物溶于3mL乙醇，加入甲氧基聚乙二醇醛基200mg(0.10mmol)，避光80℃搅拌反应24小时，得到反应液B；
(4)将步骤(3)获得的反应液B旋蒸，除去溶剂，加入6mL超纯水溶解，用超纯水透析3天，其中透析袋的截留分子量为3500Da，透析结束后，-80℃冰箱冷冻2小时，移至冷冻干燥机避光冻干，得到的深黄色固体为二甲基姜黄素前药(160.2mg，产率：78.7％)。
实施例10
本实施例提供了一种二甲基姜黄素前药，包括如下步骤：
(1)将二甲基姜黄素48mg(0.12mmol)溶于3mL甲醇，加入水合肼16.5mg(0.33mmol)，在氮气保护下，避光50℃搅拌反应12小时，得到反应液A；
(2)将步骤(1)获得的反应液A旋蒸，除去溶剂，移至冷冻干燥机避光冻干，得到的深黄色固体为二甲基姜黄素衍生物；
(3)将步骤(2)获得的二甲基姜黄素衍生物溶于3mL甲醇，加入甲氧基聚乙二醇醛基200mg(0.10mmol)，避光50℃搅拌反应12小时，得到反应液B；
(4)将步骤(3)获得的反应液B旋蒸，除去溶剂，加入6mL超纯水溶解，用超纯水透析3天，其中透析袋的截留分子量为3500Da，透析结束后，-80℃冰箱冷冻2小时，移至冷冻干燥机避光冻干，得到的深黄色固体为二甲基姜黄素前药(147.4mg，产率：72.4％)。
实施例11
本实施例提供了一种二甲基姜黄素前药，包括如下步骤：
(1)将二甲基姜黄素48mg(0.12mmol)溶于3mL甲醇，加入水合肼16.5mg(0.33mmol)，在氮气保护下，避光50℃搅拌反应36小时，得到反应液A；
(2)将步骤(1)获得的反应液A旋蒸，除去溶剂，移至冷冻干燥机避光冻干，得到的深黄色固体为二甲基姜黄素衍生物；
(3)将步骤(2)获得的二甲基姜黄素衍生物溶于3mL甲醇，加入甲氧基聚乙二醇醛基200mg(0.10mmol)，避光50℃搅拌反应36小时，得到反应液B；
(4)将步骤(3)获得的反应液B旋蒸，除去溶剂，加入6mL超纯水溶解，用超纯水透析3天，其中透析袋的截留分子量为3500Da，透析结束后，-80℃冰箱冷冻2小时，移至冷冻干燥机避光冻干，得到的深黄色固体为二甲基姜黄素前药(165.3mg，产率：81.2％)。
实施例12
本实施例提供了一种二甲基姜黄素前药，包括如下步骤：
(1)将二甲基姜黄素48mg(0.12mmol)溶于3mL甲醇，加入水合肼16.5mg(0.33mmol)，在氮气保护下，避光50℃搅拌反应48小时，得到反应液A；
(2)将步骤(1)获得的反应液A旋蒸，除去溶剂，移至冷冻干燥机避光冻干，得到的深黄色固体为二甲基姜黄素衍生物；
(3)将步骤(2)获得的二甲基姜黄素衍生物溶于3mL甲醇，加入甲氧基聚乙二醇醛基200mg(0.10mmol)，避光50℃搅拌反应48小时，得到反应液B；
(4)将步骤(3)获得的反应液B旋蒸，除去溶剂，加入6mL超纯水溶解，用超纯水透析3天，其中透析袋的截留分子量为3500Da，透析结束后，-80℃冰箱冷冻2小时，移至冷冻干燥机避光冻干，得到的深黄色固体为二甲基姜黄素前药(163.9mg，产率：80.5％)。
实施例13
本实施例提供了一种二甲基姜黄素前药，包括如下步骤：
步骤(1)～(3)和实施例1相同。
(4)将步骤(3)获得的反应液B旋蒸，除去溶剂，加入6mL超纯水溶解，用超纯水透析2天，其中透析袋的截留分子量为3500Da，透析结束后，-80℃冰箱冷冻2小时，移至冷冻干燥机避光冻干，得到的深黄色固体为二甲基姜黄素前药(141.3mg，产率：69.4％)。
实施例14
本实施例提供了一种二甲基姜黄素前药，包括如下步骤：
步骤(1)～(3)和实施例1相同。
(4)将步骤(3)获得的反应液B旋蒸，除去溶剂，加入6mL超纯水溶解，用超纯水透析4天，其中透析袋的截留分子量为3500Da，透析结束后，-80℃冰箱冷冻2小时，移至冷冻干燥机避光冻干，得到的深黄色固体为二甲基姜黄素前药(123.2mg，产率：60.5％)。
试验例1
实施例1中目标化合物二甲基姜黄素前药的化学结构确认：
采用核磁共振氢谱和红外光谱确认实施例1制备的目标化合物的化学结构。图2和图3为本发明实施例1制备的目标化合物的核磁共振氢谱图和红外光谱图。
由图2可知，二甲基姜黄素的核磁谱图在3.78～3.81和6.08～6.09、6.79～6.84、6.98～7.00、7.23～7.26、7.33、7.55～7.58分别对应于甲氧基中的甲基氢和苯环中的芳香氢、双键中的双键氢。甲氧基聚乙二醇醛基的核磁谱图在3.24～3.26、3.51～3.56、3.85～3.86和9.64ppm处出现的峰，分别对应于聚乙二醇中的甲基氢、亚甲基氢和醛基中的醛基氢。实施例1目标化合物的核磁谱图显示醛基氢的核磁信号消失和芳香氢、双键氢、甲基氢的核磁信号出现，表明二甲基姜黄素成功地与甲氧基聚乙二醇醛基结合。
由图3可知，与甲氧基聚乙二醇醛基的红外光谱图相比，二甲基姜黄素前药在1518cm
试验例2
实施例1中得到的二甲基姜黄素前药的自组装行为：
实验溶液的配制：称取本发明实施例1制备的二甲基姜黄素前药2mg，加入2mL超纯水，超声分散5min，配制成1mg/mL的水溶液；称取20mg磷钨酸，溶于1mL超纯水，配制成2％的磷钨酸水溶液。
取1mL本实施例制备的二甲基姜黄素前药水溶液，用动态光散射对本实施例制备的二甲基姜黄素前药组装体的粒径分布进行测量。
图4为本实施例制备的二甲基姜黄素前药组装体的粒径分布图。实验结果表明，本实施例制备的二甲基姜黄素前药组装体粒径呈正态分布，粒径分布较窄，平均直径约100nm。
取50μL本实施例制备的二甲基姜黄素前药水溶液，滴加在覆盖有碳支持膜的铜网上，在空气中自然干燥，然后用2％磷钨酸染色2min，用透射电子显微镜对本实施例制备的二甲基姜黄素前药组装体的形貌进行观察。
图5为本实施例制备的二甲基姜黄素前药组装体的电镜图。实验结果表明，本实施例制备的二甲基姜黄素前药组装体呈近似球形，具有纳米粒的形貌特征，粒径分布均一，直径约100nm。
试验例3
二甲基姜黄素前药自组装纳米粒的载药行为：
载药方法：称取本发明实施例1制备的二甲基姜黄素前药10mg与1.0mg二甲基姜黄素溶于3mL甲醇，在室温下搅拌4小时，旋蒸除去溶剂，加入2mL超纯水，超声5分钟，离心取上清液，得到DMC@mPEG-DMC(15.5％)纳米粒溶液。
称取本发明实施例1制备的二甲基姜黄素前药10mg与2.0mg二甲基姜黄素溶于3mL甲醇，在室温下搅拌4小时，旋蒸除去溶剂，加入2mL超纯水，超声5分钟，离心取上清液，得到DMC@mPEG-DMC(18.6％)纳米粒溶液。
称取本发明实施例1制备的二甲基姜黄素前药10mg与3.0mg二甲基姜黄素溶于3mL甲醇，在室温下搅拌4小时，旋蒸除去溶剂，加入2mL超纯水，超声5分钟，离心取上清液，得到DMC@mPEG-DMC(22.0％)纳米粒溶液。
通过高效液相色谱法检测本实施例制备的载药纳米粒的载药量。将本实施例制备的载药纳米粒称重测得质量W
将二甲基姜黄素的投料量设为W
包封率(EE)采用公式EE(％)＝DLC/DLC
本实施例制备的DMC@mPEG-DMC(15.5％)纳米粒中二甲基姜黄素的载药量和包封率分别为15.5％和96.0％，本实施例制备的DMC@mPEG-DMC(18.6％)纳米粒中二甲基姜黄素的载药量和包封率分别为18.6％和68.7％，本实施例制备的DMC@mPEG-DMC(22.0％)纳米粒中二甲基姜黄素的载药量和包封率分别为22.0％和62.5％。
试验例4
实施例1制备的mPEG-DMC(7.4％)、试验例3制备的DMC@mPEG-DMC(15.5％)、DMC@mPEG-DMC(18.6％)、DMC@mPEG-DMC(22.0％)的粒径和电荷表征：
样品制备：称取本发明实施例1制备的mPEG-DMC(7.4％)、试验例3制备的DMC@mPEG-DMC(15.5％)、DMC@mPEG-DMC(18.6％)、DMC@mPEG-DMC(22.0％)各2mg，分别用2mL超纯水溶解，超声分散5min，配制成1mg/mL的水溶液。
取1mL本试验例制备的mPEG-DMC(7.4％)、DMC@mPEG-DMC(15.5％)、DMC@mPEG-DMC(18.6％)、DMC@mPEG-DMC(22.0％)水溶液，用动态光散射对本试验例制备的mPEG-DMC(7.4％)、DMC@mPEG-DMC(15.5％)、DMC@mPEG-DMC(18.6％)、DMC@mPEG-DMC(22.0％)水溶液的粒径和电荷进行测量。
由表1可知，随着载药量的增加，样品的粒径随之增加，电位的绝对值也随之增加，样品多分散性指数均小于0.3，表明样品分散性良好。
表1.实施例1制备的mPEG-DMC(7.4％)、试验例3制备的DMC@mPEG-DMC(15.5％)、DMC@mPEG-DMC(18.6％)、DMC@mPEG-DMC(22.0％)的粒径和电荷表征结果。
试验例5
实施例1制备的mPEG-DMC(7.4％)、试验例3制备的DMC@mPEG-DMC(15.5％)、DMC@mPEG-DMC(18.6％)纳米粒的药物释放行为：
药物溶液的配制：将本发明实施例1制备的mPEG-DMC(7.4％)、试验例3制备的DMC@mPEG-DMC(15.5％)、DMC@mPEG-DMC(18.6％)溶液用超纯水稀释，配制成二甲基姜黄素浓度为180μg/mL的水溶液。
释放液的配制：
(1)释放液I(PBS pH7.4,吐温80含量为1.0％)：称取2.16g十二水合磷酸氢二钠，0.26g磷酸二氢钾，10g吐温-80，加入超纯水溶解，并定容至1000mL，然后用稀盐酸调节pH至7.4。
(2)释放液II(PBS pH5.0,吐温80含量为1.0％)：称取2.16g十二水合磷酸氢二钠，0.26g磷酸二氢钾，10g吐温-80，加入超纯水溶解，并定容至1000mL，然后用稀盐酸调节pH至5.0。
将1mL药物溶液装入透析袋中(截留分子量：3500Da)，密封，然后将装有药物溶液的透析袋浸没在30mL的释放液中，再置于摇床中震荡，温度为37℃，转速为180rpm。分别在4、8、24、36、48、60和72h时间点取出1mL释放液，再补充1mL相应的释放液。每种释放液中的药物释放实验平行做三组。药物释放实验全程在避光的条件下进行。取出的释放液通过酶标仪测定药物浓度并计算累积释放量。实施例1制备的mPEG-DMC(7.4％)、试验例3制备的DMC@mPEG-DMC(15.5％)、DMC@mPEG-DMC(18.6％)溶液的累积释放量结果见表2。
表2.实施例1制备的mPEG-DMC(7.4％)、试验例3制备的DMC@mPEG-DMC(15.5％)、DMC@mPEG-DMC(18.6％)溶液的累积释放量结果。
由表2可知，实施例1制备的mPEG-DMC(7.4％)在释放液I、释放液II中的释放速度缓慢且释放总量仅有4.70％和4.99％。试验例3制备的DMC@mPEG-DMC(15.5％)、DMC@mPEG-DMC(18.6％)溶液在pH为5.0的释放液II中释放速度明显快于pH为7.4的释放液I，并且在释放液II中释放更完全。在pH为7.4的释放液I条件下，试验例3制备的DMC@mPEG-DMC(15.5％)、DMC@mPEG-DMC(18.6％)溶液在72h的药物释放总量只有14.05％和15.56％，而在pH为5.0的释放液II条件下，试验例3制备的DMC@mPEG-DMC(15.5％)、DMC@mPEG-DMC(18.6％)溶液在72h的药物释放总量可以达到29.74％、32.50％。这表明，本发明试验例3制备的DMC@mPEG-DMC(15.5％)、DMC@mPEG-DMC(18.6％)溶液具有pH响应性药物释放的特性。图6为实施例1制备的mPEG-DMC(7.4％)、试验例3制备的DMC@mPEG-DMC(15.5％)、DMC@mPEG-DMC(18.6％)溶液的药物释放曲线图。
试验例6
实验例1制备的二甲基姜黄素前药mPEG-DMC(7.4％)、试验例3制备的DMC@mPEG-DMC(15.5％)纳米粒和DMC@mPEG-DMC(18.6％)纳米粒的体外抗肿瘤活性：
实验药物的配制：将本发明实验例1制备的二甲基姜黄素前药溶解在超纯水中，超声5min，配制成13.5mg/mL水溶液(其中二甲基姜黄素含量为1mg/mL)；将游离二甲基姜黄素溶解在二甲基亚砜中配制成4mg/mL的二甲基姜黄素溶液。
HepG-2细胞杀伤实验分为四个组，游离二甲基姜黄素实验组(DMC)、实验例1制备的二甲基姜黄素前药实验组mPEG-DMC(7.4％)、试验例3制备的DMC@mPEG-DMC(15.5％)纳米粒实验组和DMC@mPEG-DMC(18.6％)纳米粒实验组。每个实验组由配制的高浓度溶液通过DMEM培养基稀释成0.1、1、5、10和20μg/mL的浓度并加入至96孔板中和细胞孵育，每孔细胞数量约为5000，每个实验组中的每个浓度重复4个孔，然后培养48h和72h。
细胞存活率通过MTT方法检测，以空白培养基孵育的细胞作为100％存活率。游离二甲基姜黄素实验组(DMC)、实验例1制备的二甲基姜黄素前药实验组mPEG-DMC(7.4％)、试验例3制备的DMC@mPEG-DMC(15.5％)纳米粒实验组和DMC@mPEG-DMC(18.6％)纳米粒实验组对HepG-2细胞杀伤效果见图7。
由图7可知，孵育48h的实验组，游离二甲基姜黄素实验组、DMC@mPEG-DMC(15.5％)纳米粒实验组和DMC@mPEG-DMC(18.6％)纳米粒实验组细胞存活率相接近，抑制HepG-2细胞生长作用明显，而二甲基姜黄素前药本身对HepG-2细胞没有明显的杀伤作用。孵育72h的实验组，与游离二甲基姜黄素实验组相比，试验例3制备的DMC@mPEG-DMC(15.5％)纳米粒实验组和DMC@mPEG-DMC(18.6％)纳米粒实验组的细胞存活率接近甚至更低，抑制HepG-2细胞生长作用明显。试验例3制备的DMC@mPEG-DMC(15.5％)纳米粒实验组和DMC@mPEG-DMC(18.6％)纳米粒实验组比游离二甲基姜黄素具有相似的HepG-2细胞杀伤作用。而二甲基姜黄素前药本身对HepG-2细胞没有明显的杀伤作用。整体来说,DMC@mPEG-DMC(15.5％)纳米粒实验组和DMC@mPEG-DMC(18.6％)纳米粒实验组对HepG-2细胞的杀伤效果不如对22Rv1细胞的杀伤效果。
22Rv1细胞杀伤实验分为四个组，游离二甲基姜黄素实验组(DMC)、实验例1制备的二甲基姜黄素前药实验组mPEG-DMC(7.4％)、试验例3制备的DMC@mPEG-DMC(15.5％)纳米粒实验组和DMC@mPEG-DMC(18.6％)纳米粒实验组。每个实验组由配制的高浓度溶液通过1640培养基稀释成0.1、1、5、10和20μg/mL的浓度并加入至96孔板中和细胞孵育，每孔细胞数量约为5000，每个实验组中的每个浓度重复4个孔，然后培养48h和72h。
细胞存活率通过MTT方法检测，以空白培养基孵育的细胞作为100％存活率。游离二甲基姜黄素实验组(DMC)、实验例1制备的二甲基姜黄素前药实验组mPEG-DMC(7.4％)、试验例3制备的DMC@mPEG-DMC(15.5％)纳米粒实验组和DMC@mPEG-DMC(18.6％)纳米粒实验组对22Rv1细胞杀伤效果见图7。
由图7可知，孵育48h的实验组，DMC@mPEG-DMC(15.5％)纳米粒实验组和DMC@mPEG-DMC(18.6％)纳米粒实验组细胞存活率相接近，与游离二甲基姜黄素实验组相比，前两者的细胞存活率更低，抑制22Rv1细胞生长作用更为明显。相比游离二甲基姜黄素实验组(IC
最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之。
