川陕哲罗鲑内参基因及其荧光定量PCR引物与稳定性筛选方法

摘要

本发明公开了川陕哲罗鲑内参基因及其荧光定量PCR引物与稳定性筛选方法。本发明筛选出六种内参基因β‑肌动蛋白、β2‑微球蛋白、延伸因子1α、甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶、次黄嘌呤‑鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶1和β微管蛋白基因，并设计其扩增引物和荧光定量PCR引物，其稳定性筛选方法包括以下步骤：提取川陕哲罗鲑组织的RNA，并反转录合成cDNA，然后以cDNA为模板，进行实时荧光定量分析，最后对结果进行组织稳定性分析。本发明方法构建了六种内参基因的扩增引物和荧光定量PCR引物，通过分析各候选参考基因的表达变化，筛选出相对稳定的基因作为内参基因，为研究川陕哲罗鲑基因表达水平的变化奠定良好的基础。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种川陕哲罗鲑内参基因及其荧光定量PCR引物与稳定性筛选方法。

背景技术

川陕哲罗鲑(Hucho bleekeri)作为我国特有物种，曾在岷江和青衣江上游、大渡河中上游、汉江支流渭水河和太白河以及秦岭南部山溪中分布，属长江上游珍稀鱼类。但由于过度捕捞、生态环境破坏等原因，使其自然资源量直线下降。目前，川陕哲罗鲑的研究主要集中在早期发育、形态特征、遗传多样性、资源保护等方面，分子方面研究还存在空缺。

实时荧光定量PCR主要是通过检测聚合酶链式反应中的荧光信号对特定DNA模板进行定量检测的一种手段。其中，相对定量，即更具一个已知且表达稳定的内参基因作为参照，对待测基因的表达量进行检测。因此，这个内参基因的稳定性就显得尤为重要。β-肌动蛋白(β-actin)作为内参基因在动植物中被广泛用于相对表达量检测，但是根据不同的物种、不同发育阶段、不同营养状况等条件，内参基因的稳定性也是存在差异的。主要的内参候选基因还包括β2-微球蛋白(β2m)、延伸因子1α(elongation factor 1α，ef1α)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，gapdh)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶1(hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase，hprt1)和β微管蛋白基因(β-tubulin)等，挑选表达稳定的内参基因是进行实时定量PCR分析的重要前提，但目前有关川陕哲罗鲑内参基因及其筛选的研究还未见报道。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供川陕哲罗鲑内参基因及其荧光定量PCR引物与稳定性筛选方法，以解决现有缺少川陕哲罗鲑内参基因及其稳定性筛选方法的问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种川陕哲罗鲑内参基因，内参基因为：β-肌动蛋白、β2-微球蛋白、延伸因子1α、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶1和β微管蛋白基因；

β-肌动蛋白基因序列如SEQ ID No.1所示，β2-微球蛋白基因序列如SEQ ID No.2所示，延伸因子1α基因序列如SEQ ID No.3所示，甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因序列如SEQ IDNo.4所示，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶1基因序列如SEQ ID No.5所示，β微管蛋白基因序列如SEQ ID No.6所示。

用于扩增上述的川陕哲罗鲑内参基因的引物，引物序列为：β-肌动蛋白基因扩增引物序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，β2-微球蛋白基因扩增引物序列如SEQ IDNo.9和SEQ ID No.10所示，延伸因子1α基因扩增引物序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示，甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因扩增引物序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶1基因扩增引物序列如SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示，β微管蛋白基因扩增引物序列如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示。

用于检测上述川陕哲罗鲑内参基因表达的荧光定量PCR引物，引物序列为：β-肌动蛋白基因荧光定量PCR引物序列如SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示，β2-微球蛋白基因荧光定量PCR引物序列如SEQ ID No.21和SEQ ID No.22所示，延伸因子1α基因荧光定量PCR引物序列如SEQ ID No.23和SEQ ID No.24所示，甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因荧光定量PCR引物序列如SEQ ID No.25和SEQ ID No.26所示，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶1基因荧光定量PCR引物序列如SEQ ID No.27和SEQ ID No.28所示，β微管蛋白基因荧光定量PCR引物序列如SEQ ID No.29和SEQ ID No.30所示。

一种用于川陕哲罗鲑内参基因稳定性筛选的试剂盒，包括上的荧光定量PCR引物。

一种川陕哲罗鲑内参基因稳定性筛选方法，包括以下步骤：

提取川陕哲罗鲑组织的RNA，并反转录合成cDNA，然后以cDNA为模板，使用上述荧光定量PCR引物或试剂盒进行实时荧光定量分析，最后对结果进行组织稳定性分析。

进一步地，RNA的提取方法包括以下步骤：取川陕哲罗鲑组织研磨，溶于RNAisoPlus中，离心取上清液加入氯仿，混匀静置；再次离心后取上清液加入异丙醇，再次混匀静置；第三次离心去除上清液，洗涤，溶于DEPC水。

进一步地，川陕哲罗鲑组织包括脑、头肾、中肾、肌肉、心、后肠、十二指肠、皮肤、脾、肝、性腺、眼睛、鳃和胃中的一种。

进一步地，荧光定量分析的反应体系为20μL体系：TB Green Premix Ex Taq II，模板cDNA 1μL，荧光定量PCR引物正、反向引物各0.5μL，ddH

进一步地，荧光定量分析的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性10s，62.6-63℃退火30s，共40个循环。

本发明具有以下有益效果：

本发明方法构建了六种内参基因的扩增引物和荧光定量PCR引物，通过分析各候选参考基因的表达变化，筛选出相对稳定的基因作为内参基因，为研究川陕哲罗鲑基因表达水平的变化奠定良好的基础，有助于在对川陕哲罗鲑基因表达研究中获得可靠的标准化qRT-PCR数据，极大程度上节省实验技术人员时间，提高检测效率，同时检测结果稳定、可靠、准确，可广泛应用于川陕哲罗鲑科学研究。

附图说明

图1为β-肌动蛋白(β-actin)的溶解曲线与扩增效率图，其中，A图为溶解曲线，B图为扩增效率；

图2为β2-微球蛋白(β2m)的溶解曲线与扩增效率图，其中，A图为溶解曲线，B图为扩增效率；

图3为延伸因子1α(ef1α)的溶解曲线与扩增效率图，其中，A图为溶解曲线，B图为扩增效率；

图4为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)的溶解曲线与扩增效率图，其中，A图为溶解曲线，B图为扩增效率；

图5为次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶1(hprt1)的溶解曲线与扩增效率图，其中，A图为溶解曲线，B图为扩增效率；

图6为β微管蛋白基因(β-tubulin)的溶解曲线与扩增效率图，其中，A图为溶解曲线，B图为扩增效率；

图7为Genorm、NormFinder和Bestkeeper软件对结果进行组织稳定性分析结果图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例：

一种川陕哲罗鲑内参基因稳定性筛选的方法，包括以下步骤：

(1)组织RNA提取

取川陕哲罗鲑肝脏组织于液氮中研磨至粉状后，取30mg溶于1mL RNAiso Plus(Takara)中，12000×g离心5min后取上清液加入200mL氯仿，混匀静置10min；再12000×g离心10min后去掉上清液，用体积分数为75％的乙醇溶液洗涤2次，将RNA溶于20μl DEPC水。用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，用超微量分光光度计检测RNA浓度。

(2)cDNA合成

使用PrimeScript

(3)克隆引物设计

根据川陕哲罗鲑全场转录组测序结果，检索到β-肌动蛋白(β-actin)、β2-微球蛋白(β2m)、延伸因子1α(elongation factor 1α，ef1α)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，gapdh)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶1(hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase，hprt1)和β微管蛋白基因(β-tubulin)六种候选内参基因序列，β-actin基因序列如SEQ ID No.1所示，β2m基因序列如SEQ ID No.2所示，ef1α基因序列如SEQ ID No.3所示，gapdh基因序列如SEQ ID No.4所示，hprt1基因序列如SEQ ID No.5所示，β-tubulin基因序列如SEQ ID No.6所示。并分别设计其扩增引物：

β-actin扩增引物正向引物序列如SEQ ID No.7所示，反向引物序列如SEQ IDNo.8所示；

β2m扩增引物正向引物序列如SEQ ID No.9所示，反向引物序列SEQ ID No.10所示；

ef1-α扩增引物正向引物序列如SEQ ID No.11所示，反向引物序列如SEQ IDNo.12所示；

gapdh扩增引物正向引物序列如SEQ ID No.13所示，反向引物序列如SEQ IDNo.14所示；

hprt1扩增引物正向引物序列如SEQ ID No.15所示，反向引物序列如SEQ IDNo.16所示；

β-tubulin扩增引物正向引物序列如SEQ ID No.17所示，反向引物序列如SEQ IDNo.18所示。

(4)PCR扩增

利用步骤(2)获得的川陕哲罗鲑肝脏cDNA进行PCR扩增，程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。使用质量分数为1％琼脂糖凝胶电泳进行分离目的片段，并进行胶回收。根据胶回收试剂盒对PCR产物中的DNA目的片段进行收集。使用pMD-18T载体连接转化后送生工生物工程股份有限公司测序。

(5)荧光定量PCR引物设计

将测序结果进行同源性比较，确定克隆得到的六种基因片段为目的基因。然后使用DNAman软件进行引物设计，控制产物片段大小在100-300bp之间，尽量避免发卡结构和引物二聚体。

荧光定量PCR引物：

β-actin荧光定量PCR引物正向引物序列如SEQ ID No.19所示，反向引物序列如SEQ ID No.20所示；

β2m荧光定量PCR引物正向引物序列如SEQ ID No.21所示，反向引物序列SEQ IDNo.22所示；

ef1α荧光定量PCR引物正向引物序列如SEQ ID No.23所示，反向引物序列如SEQID No.24所示；

gapdh荧光定量PCR引物正向引物序列如SEQ ID No.25所示，反向引物序列如SEQID No.26所示；

hprt1荧光定量PCR引物正向引物序列如SEQ ID No.27所示，反向引物序列如SEQID No.28所示；

β-tubulin荧光定量PCR引物正向引物序列如SEQ ID No.29所示，反向引物序列如SEQ ID No.30所示。

(6)目的基因组织表达

分别取3尾川陕哲罗鲑的14个组织，包括脑、头肾、中肾、肌肉、心、后肠、十二指肠、皮肤、脾、肝、性腺、眼睛、鳃和胃，进行组织RNA提取和cDNA合成，方法同步骤(1)和步骤(2)。

以合成得到的组织cDNA为模板，通过步骤(5)设计得到的荧光定量PCR引物进行实时荧光定量分析。

反应体系为20μL体系：TB Green Premix Ex Taq II(Takara)10μL，模板cDNA 1μL，荧光定量PCR引物正、反向引物各0.5μL，ddH

反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性10s，62.6-63℃退火30s，共40个循环；4℃保存；每个反应做3个重复。

通过上述的反应条件进行扩增，扩增效率在90％-100％之间，如图1-6所示，六个候选基因的扩增效率E与R

(7)相对表达量与稳定性分析

使用2

实验结果如图7所示，根据Genorm结果显示，六个内参候选基因的稳定性排序为β-actin/ef1α>hptr1>β-tubulin>β2m>gapdh；根据NormFinder结果显示，六个内参候选基因的稳定性排序为ef1α>β-tubulin>β-actin>hptrl>β2m>gapdh；根据Bestkeeper结果显示β-tubulin>ef1a>β-actin>hptr1>β2m>gapdh。因此，在正常条件下ef1α是各个组织中表达最稳定的内参基因，若使用双内参的情况下推荐使用ef1α和β-tubulin。

综上所述，本发明共鉴定得到六种内参基因的核苷酸序列，并成功设计出六对扩增引物和六对有效的荧光定量PCR引物，筛选出了表达最为稳定的内参基因，极大程度上节省实验技术人员时间，提高检测效率，同时检测结果稳定、可靠、准确，可广泛应用于川陕哲罗鲑科学研究。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。