一种新型冠状病毒奥密克戎株中和抗体检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明属于生物技术领域，公开了一种新型冠状病毒中和抗体检测方法及一种新型冠状病毒奥密克戎株中和抗体检测试剂盒及检测方法，利用胶体金免疫层析分析仪、胶体金免疫层析试纸条，利用假病毒中和抗体检测方法进行血清样品中和抗体滴度测定，将获得的平均拟合曲线录入到胶体金免疫层析分析仪软件系统中，作为定量检测的标准曲线，对全血、血清、血浆等样品中新冠中和抗体进行定量检测。本发明以创新性的检测方法改进实现了胶体金试剂盒的定量检测，并主要应用于奥密克戎株。该方法成本较低且安全、操作简便、快速定量、灵敏度高且重复性好，具有突出的技术优势。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种新型冠状病毒奥密克戎株中和抗体检测试剂盒及检测方法。

背景技术

冠状病毒在系统分类上属套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。冠状病毒属的病毒是具囊膜(envelope)、基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。直径约80～120nm，其遗传物质是所有RNA病毒中最大的，感染宿主包括人、鼠、猪、猫、犬、狼、鸡、牛、禽类等脊椎动物。2019新型冠状病毒(SARS-CoV-19,曾用名2019-nCoV)是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，其余6种分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。研究表明，其中SARS-CoV-19、SARS-CoV和HCoV-NL63是通过病毒包膜spikeglycoprotein(S-protein)介导病毒与宿主细胞膜上的ACE2受体相互作用来感染人的。现有的冠状病毒核酸检测方法包括全基因组测序、RT-PCR法、CRISPR、逆转录环冠状病毒在系统分类上属套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。

WHO将在南非发现的新冠B.1.1.529毒株正式命名为“Omicron”(音译：奥密克戎)。同时，WHO将这种病毒列为VOC级别，意为值得关注的变种。南非自11月以来出现了新冠感染者爆发，确诊病例快速增加，代表了新一轮疫情来临。经过测序，Omicron毒株刺突蛋白变异数量达到32处，是此前德尔塔Delta毒株的两倍。研究发现，Omicron突变数量众多。根据基因测序结果，Omicron变异株的S蛋白上面有超过30个氨基酸突变、3个小缺失和1个小插入刺突蛋白。如果只看RBD区域的话，对比原始毒株：Beta有3个突变，Delta有2个突变，Omicron有15个突变。

新冠疫情在全球蔓延，寻找有效药物仍然是控制疫情、拯救生命的关键因素，然而，在老药新用的策略下，科学家们至今尚未找到一种特效药物，与此同时，另一种可能性备受关注，这就是中和抗体。

现有的冠状病毒核酸检测方法包括全基因组测序、RT-PCR法、CRISPR、逆转录环介导等温扩增法(RT-LAMP)和实时RT-LAMP等。针对SARS-CoV-2核酸的检测，当前最为普遍适用的方法是实时荧光定量PCR法，即通过对标本中的病毒RNA进行提取、逆转录、PCR扩增特定保守序列后，通过荧光等常规方法进行显示。

目前，对疫情中或疫情后流行病血清学调查主要是检测血清总抗体；但如果能同时检测出中和抗体的含量则对预后及再次感染的风险评估具有重要意义。同样，对于接种疫苗后如果能在检测总抗体的同时检测中和抗体的含量，则对评估疫苗的效果及是否需要和何时再次免疫具有重要意义。根据目前疫苗临床研究结果，97％以上的人接种疫苗后都能产生中和抗体。但是所有的疫苗都不可能是百分之百产生抗体，这主要跟个体差异有关。一般采用的技术方法包括酶联免疫法、化学发光法和胶体金法三种方法。化学发光法和酶联免疫法能够定量、灵敏度高、通量高，但需要熟练的实验室人员进行操作，并且需要昂贵的检测设备。普通胶体金法具有检测速度快、不需要依赖检测设备的优点，但也有灵敏度较低、不能定量的缺点。因此，我们建立了一种便捷、操作简便、快速、特异性好、定量准确的中和抗体检测方法。

发明内容

为了解决现有技术上存在的不足，本发明提供了一种新型冠状病毒奥密克戎株检测试剂盒制备及检测方法，并以创新性的检测方法改进实现了胶体金试纸条的定量检测。该方法便捷、操作简便、快速定量、特异性好、灵敏度高且重复性好，具有突出的技术优势。

本发明提供了一种新型冠状病毒奥密克戎株中和抗体检测试剂盒；

本发明提供了一种包括上述试剂盒的检测方法；

本发明提供了一种中和抗体的定量检测方法。

检测试剂盒的制备：

(1)准备2019-nCoV奥密克戎株重组抗原；

(2)制备结合垫：制备胶体金，通过调节胶体金的pH值将胶体金分别与2019-nCoV奥密克戎株重组抗原及鼠抗人HCG单克隆抗体结合得2019-nCoV奥密克戎株重组抗原标记胶体金及鼠抗人HCG单克隆抗体标记胶体金，然后分别采用2019-nCoV奥密克戎株重组抗原标记胶体金及鼠抗人HCG单克隆抗体标记胶体金包被结合垫；

(3)制备分析膜：在硝酸纤维素膜上采用0.1uL/mm的喷点量喷涂小鼠抗人IgG单克隆抗体制备T1，在硝酸纤维素膜上采用0.1uL/mm的喷点量喷涂山羊抗小鼠IgG多克隆抗体制备质控线；

(4)试剂条的组装：在PVC底板上沿层析方法依次铺设样品垫、结合垫、分析膜及吸水滤纸，并且样品垫部分搭接在结合垫上，结合垫部分搭接在分析膜的一侧，吸水滤纸部分搭接在分析膜的另一侧，得试剂条。

本发明中，可选地，采用100ml1/万氯金酸及1.8ml1％柠檬酸三钠制备胶体金；胶体金分别与2019-nCoV奥密克戎株重组抗原及鼠抗人HCG单克隆抗体结合的条件为：每毫升胶体金中加入20μL的0.1M的碳酸钾溶液，将胶体金的pH值调节为8.5±0.2，然后分别采用15μg/mL的鼠抗人HCG单克隆抗体及15μg/mL的2019-nCoV奥密克戎株重组抗原标记胶体金。

本发明中，可选地，采用的小鼠抗人IgG单克隆抗体的浓度为1-3mg/ml，采用的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体的浓度为2.0mg/mL。

本发明中制备的新型冠状病毒检测试纸条的宽度范围为3.4～4.0mm，T2检测线处包被小鼠抗人IgG单克隆抗体的量由小鼠抗人IgG单克隆抗体的浓度和小鼠抗人IgG单克隆抗体喷点量共同决定、质控线处包被山羊抗小鼠IgG多克隆抗体的量由山羊抗小鼠IgG多克隆抗体的浓度和山羊抗小鼠IgG多克隆抗体喷点量共同决定。

一种新型冠状病毒奥密克戎株中和抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括检测卡；

所述检测卡包括结合垫和分析膜，所述结合垫上包被标记发光物标记的2019-nCoV重组抗原和鼠抗人HCG单克隆抗体；沿层析方向在所述分析膜上依次设有T1检测线及质控线，所述T1检测线处包被小鼠抗人IgG单克隆抗体，所述质控线处包被山羊抗小鼠IgG多克隆抗体。

本发明中，可选地，所述2019-nCoV重组抗原携带His-Tag。

His-Tag即His-tag单抗，又叫6*His-tag单抗或6*His单克隆抗体；采用His-Tag对2019-nCoV重组抗原进行标记，具有下述优势：

(1)N-端的His-Tag与细菌的转录翻译机制兼容，有利于蛋白表达；

(2)采用固定化金属离子亲合层析纯化His-Tag融合蛋白操作更加简便；

(3)His-Tag对2019-nCoV重组抗原本身特性几乎没有影响，不会改变2019-nCoV重组抗原本身的可溶性和生物学功能；

(4)His-Tag非常小，一般不影响蛋白质的功能，且在融合蛋白结晶后对蛋白的结构没有影响；

(5)His-Tag的免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射入动物体内进行免疫并制备抗体；

(6)与其它亲和标签构建成双亲和标签，并可应用于多种表达系统，纯化的条件温和；His-Tag融合蛋白的适用范围也较广，既可以在非离子型表面活性剂存在的条件下纯化，通常用来纯化疏水性强的目的蛋白；也可以在变性条件下进行纯化，通常用来纯化包涵体蛋白。

在本发明中，可选地，所述标记发光物为胶体金，所述结合垫为胶体金垫，所述分析膜为硝酸纤维素膜。

在本发明中，可选地，所述检测试纸条还包括PVC底板、样品垫和吸水滤纸，沿层析方向在所述PVC底板上依次铺设有样品垫、结合垫、分析膜及吸水滤纸，所述样品垫部分搭接在所述结合垫上，所述结合垫部分搭接在所述分析膜的一侧，所述吸水滤纸部分搭接在所述分析膜的另一侧；所述样品垫上设有加样孔。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：①本发明的成本较低且安全；②本发明的方法便捷、灵敏度高、特异性好；③经试验证明，本发明的方法能快速精准筛查康复人群的中和抗体水平，并适用于疫苗接种后，接种人群的中和抗体水平的评估；④操作简单，现场快速检测，15min内出结果。

附图说明

图1是新型冠状病毒检测试纸条的结构示意图。

图2是四参数拟合中和抗体定量标准曲线。

具体实施方式

本发明所述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例基于胶体金免疫层析法的新型冠状病毒中和抗体快速定量检测方法和试剂盒的制备。

本发明提供的新型冠状病毒检测试纸条包括PVC底板1，沿层析方向在PVC底板1依次铺设的样品垫2、结合垫3、分析膜4和吸水滤纸5；样品垫2部分搭接在结合垫3上，结合垫3部分搭接在分析膜4的一侧，吸水滤纸5部分搭接在分析膜4的另一侧，样品垫2上设置有加样孔21。

结合垫3上包被胶体金标记的2019-nCoV重组抗原和鼠抗人HCG单克隆抗体标记胶体金；2019-nCoV奥密克戎株重组抗原携带His-Tag；结合垫可以为胶体金垫。

沿层析方向在分析膜4上依次设有T1检测线41及质控线42，T1检测线41处包被小鼠抗人IgG单克隆抗体，质控线42处包被山羊抗小鼠IgG多克隆抗体。分析膜4上的T1检测线41及质控线42之间相互保持相对平行状态。分析膜4可以是硝酸纤维素膜。(见图2)

该新型冠状病毒检测试纸条的制备方法如下：

步骤1、准备2019-nCoV奥密克戎株重组抗原；

步骤2、制备结合垫3；其制备方法为：采用100ml的1/万氯金酸及1.8ml的1％柠檬酸三钠制备胶体金，然后将胶体金的pH值调节为8.5，每毫升胶体金中加入20μL的0.1M的碳酸钾溶液，然后分别采用15μg/mL的鼠抗人HCG单克隆抗体及15μg/mL的2019-nCoV奥密克戎株重组抗原标记胶体金，得到2019-nCoV奥密克戎重组抗原标记胶体金及鼠抗人HCG单克隆抗体标记胶体金，最后分别采用2019-nCoV奥密克戎重组抗原标记胶体金及鼠抗人HCG单克隆抗体标记胶体金包被结合垫3，即得。

步骤3，制备分析膜4；其制备方法为：在硝酸纤维素膜上采用0.1uL/mm的喷点量喷涂1-3mg/ml的小鼠抗人IgG单克隆抗体制备T1检测线41，在硝酸纤维素膜上采用0.1uL/mm的喷点量喷涂2.0mg/mL山羊抗小鼠IgG多克隆抗体制备质控线42。

步骤4，试剂条的组装：在PVC底板1上沿层析方向依次铺设样品垫2、结合垫3、分析膜4及吸水滤纸5，并且样品垫2部分搭接在结合垫3上，结合垫3部分搭接在分析膜4的一侧，吸水滤纸5部分搭接在分析膜4的另一侧，即得。

本实施例中，硝酸纤维素膜购自赛多利斯公司，外感为白色、质地均匀、膜表面平整无瑕疵、膜边缘整齐无扭曲变形，液体移行速度为135S±35S/4cm,爬上过程中无倾斜、无润湿现象。

金标垫购自上海金标生物科技有限公司，其纤维结构分布均匀、致密、平直、周围边缘无脏痕、污垢、灰尘，吸水性为63.1mg/cm

本实施例制备的新型冠状病毒检测试纸条宽度范围为3.4～4.0mm，液体移行速度应不低于10mm/min。

本发明提供的检测方法具体步骤如下：

1)标准曲线的建立

利用omicron BA.1株假病毒中和抗体检测方法进行血清样品中和抗体滴度测定，确定血清中和抗体浓度为1000BU/mL。

将中和抗体浓度为1000BU/mL的血清样品，以纯化水进行6个梯度的稀释，分别是10BU/mL、20BU/mL、60BU/mL、180BU/mL、360BU/mL、540BU/mL、按要求使用新冠中和抗体试纸条进行测试，每个梯度分别测试5组，分别将每次检测的试纸条放入胶体金免疫层析分析仪中读取胶体金反应值。结果如下表所示：

表1 血清样品中和抗体的胶体金反应值

在胶体金免疫分析仪上位机软件上，将中和抗体浓度(BU/mL)与胶体金平均反应值进行“四参数增长”拟合，得到四参数拟合中和抗体定量标准曲线见图1。

表2 四参数拟合中和抗体定量标准曲线参数及结果

2)CUT OFF值的界定

将样本进行连续稀释，加入到胶体金试纸条上，经胶体金分析仪检测后，得到胶体金反应值结果如下表3。

表3 不同浓度中和抗体对应的胶体金反应值

由上表可以看出，中和抗体浓度高于或等于0.05BU/mL时，胶体金反应值为阳性，低于0.05BU/mL时，仪器检测的胶体金反应值为0；然后分别重复测试5次0.05BU/mL和0.02BU/mL两种中和抗体浓度，高于或等于0.05BU/mL时，仪器检测的胶体金反应值为阳性；低于0.05BU/mL时，仪器检测的胶体金反应值为阴性，因此将CUT OFF值定为0.05BU/mL。

3)定量检测

将试剂曲线录入到胶体金分析仪中，对10份系列浓度血清样品进行测试，得出相对应的胶体金反应值，运用四参数拟合中和抗体定量标准曲线，计算得出中和抗体浓度值，并与血清样品理论浓度计算相对误差，确定定量检测的可行性。不同浓度的血清样品中和抗体测得的胶体金反应值结果见表4。

表4 不同浓度的标准品中和抗体测得的胶体金反应值结果

由上表可以看出，4个浓度的血清样品测得的中和抗体浓度的相对标准偏差(RSD)不高于10％，证明重复性较好。

取20份接种新冠疫苗3针后14天以上的志愿者血清，利用本发明研制的试剂条进行中和抗体胶体金法检测，结果见表5。

表5 20名志愿者的测试结果

由上表可知，本发明的检测方法可以快速精准筛查人群的新冠病毒奥密克戎株中和抗体水平，对新冠疫苗的效果评估和接种人群的筛查奥密克戎株中和抗体水平评估具有重要意义。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，在本发明所记载的技术范围内，进行修改或对其部分技术特征进行等同替换,在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，并保留所有权利，均属于本发明要求保护的范围。