MiR-1909-5p在制备治疗血管内皮细胞铁死亡和/或主动脉夹层产品中的应用

摘要

本发明公开了一种MiR‑1909‑5p在制备治疗血管内皮细胞铁死亡和/或主动脉夹层产品中的应用；本发明miR‑1909‑5p能够负调控GPX4的表达，进而miR‑1909‑5P抑制剂通过靶向GPX4，能够减轻尼古丁诱导的HUVECs铁死亡，并进一步减缓AD进展，实现AD的治疗目的；因此，抑制miR‑1909‑5p成为了改善长期吸烟AD患者主动脉功能的新策略。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种MiR-1909-5p在制备治疗血管内皮细胞铁死亡和/或主动脉夹层产品中的应用。

背景技术

AD(aortic dissection,AD)是一种危及生命的主动脉疾病。其发病率有上升趋势。AD的症状和表现复杂多样。典型症状为灾难性的胸部和背部撕裂痛。当内膜撕裂蔓延至心血管系统其他部位时，也可引起急性冠脉综合征、主动脉瓣关闭不全和胃肠缺血等并发症。

目前AD的诊断主要依靠以计算机体层摄影血管造影(computerized tomographyangiography,CTA)为代表的影像学手段。作为AD诊断的“金标准”，CTA的辐射剂量大、易形成心脏搏动伪影且经肾脏代谢，其在孕妇、幼儿、对造影剂过敏和肾功能不全者中应用受限。而磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)扫描时间长且不适用于体内存在磁性物质的患者。超声心动图(echocardiography,ECG)与其他影像学方法相比具有操作简单、快速、适应性强及可重复性佳等优点，并且其可实时动态多角度地成像、确认内膜破口、观察主动脉根和心包或胸腔积液积血及定性定量地评估主动脉瓣反流。此外ECG在术后随访中对于血栓、假性动脉瘤及逆行性撕裂的检出也具有独特优势。因此其成为最常用的AD诊断手段。但ECG对肥胖和肺气肿等人群的AD检出受限。且ECG对降主动脉夹层的检测不敏感，诊断检出率较低。在治疗方面，AD主要采用外科开放手术和血管腔内修复。但即使经过手术干预，AD患者的病死率仍然较高。接受腔内修复术的B型AD患者发病2周内的早期死亡率为10.2％，而接受开放手术的B型AD患者的死亡率更高，为17.5％。手术治疗的A型AD患者死亡率也高达26％。因此上述诊治策略均不能有效干预AD的病理进程。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种MiR-1909-5p在制备治疗血管内皮细胞铁死亡和/或主动脉夹层产品中的应用，miR-1909-5p能够负调控GPX4的表达，进而miR-1909-5P抑制剂通过靶向GPX4，能够减轻尼古丁诱导的HUVECs铁死亡，并进一步减缓AD进展，实现AD的治疗目的。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明第一方面提供了一种MiR-1909-5p在制备治疗血管内皮细胞铁死亡和/或主动脉夹层产品中的应用。

优选地，MiR-1909-5p抑制剂在制备抑制血管内皮细胞铁死亡产品中的应用。

优选地，所述MiR-1909-5p抑制剂包括MiR-1909-5p inhibitor和/或miR-1909-5pantagomir。

优选地，所述MiR-1909-5p inhibitor的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述miR-1909-5p antagomir的正义链核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，反义链核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

优选地，所述产品包括药品和食品。

本发明第二方面提供了一种抑制血管内皮细胞铁死亡的药物，所述药物包括治疗有效量的所述MiR-1909-5p抑制剂和药学上可接受的辅料。

本发明第三方面提供了一种MiR-1909-5p抑制剂在制备治疗主动脉夹层产品中的应用。

优选地，所述MiR-1909-5p抑制剂的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选地，所述miR-1909-5p抑制剂的正义链核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，反义链核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

优选地，所述产品包括药品和食品。

本发明第四方面提供了一种治疗主动脉夹层的药物，所述药物包括治疗有效量的所述MiR-1909-5p抑制剂和药学上可接受的辅料。

与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：

本发明miR-1909-5p能够负调控GPX4的表达，进而miR-1909-5P抑制剂通过靶向GPX4，能够减轻尼古丁诱导的HUVECs铁死亡，并进一步减缓AD进展，实现AD的治疗目的；因此，抑制miR-1909-5p成为了改善长期吸烟AD患者主动脉功能的新策略。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。

图1为本发明实施例中长期吸烟的AD患者和尼古丁处理的AD小鼠主动脉内膜铁死亡明显的研究结果；

图2为本发明实施例中尼古丁可在体外引起内皮细胞铁死亡的研究结果；

图3为本发明实施例中MiR-1909-5p靶向调控内皮细胞GPX4的研究结果；

图4为本发明实施例中过表达miR-1909-5p对尼古丁诱导的内皮细胞铁死亡的研究结果；

图5为本发明实施例中敲低miR-1909-5p对尼古丁诱导的内皮细胞铁死亡的研究结果；

图6、图7和图8为本发明实施例中敲低miR-1909-5p在吸烟AD小鼠中的治疗效果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

本发明实施例提供了一种MiR-1909-5p在制备治疗血管内皮细胞铁死亡和/或主动脉夹层产品中的应用。

本发明miR-1909-5p能够负调控GPX4的表达，进而miR-1909-5P抑制剂通过靶向GPX4，能够减轻尼古丁诱导的HUVECs铁死亡，并进一步减缓AD进展，实现AD的治疗目的。

在一些实施方式中，MiR-1909-5p抑制剂在制备抑制血管内皮细胞铁死亡产品中的应用。

在一些实施方式中，所述MiR-1909-5p抑制剂包括MiR-1909-5p inhibitor和/或miR-1909-5p antagomir。

在一些实施方式中，所述MiR-1909-5p inhibitor的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为CAGGGCAGGCACCGGCACUCA。所述miR-1909-5pantagomir的正义链核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体为GCAGUCAAAUGCUCUACCACUGAGCUAUACCCCCC；

反义链核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，具体为GGGUAUAGCUCAGUGGUAGAGCAUUUGACUGCUU。

本发明对上述产品类型不作限制，可以为药品，也可以为食品。

本发明另一实施例提供了一种抑制血管内皮细胞铁死亡的药物，所述药物包括治疗有效量的所述MiR-1909-5p抑制剂和药学上可接受的辅料。

本发明又一实施例提供了一种MiR-1909-5p抑制剂在制备治疗主动脉夹层产品中的应用。

在一些实施方式中，所述MiR-1909-5p抑制剂包括MiR-1909-5p inhibitor和/或miR-1909-5p antagomir。

在一些实施方式中，所述MiR-1909-5p inhibitor的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述miR-1909-5p antagomir的正义链核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；反义链核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明对上述产品类型不作限制，可以为药品，也可以为食品。

本发明再一实施例提供了一种治疗主动脉夹层的药物，所述药物包括治疗有效量的所述MiR-1909-5p抑制剂和药学上可接受的辅料。

以下通过具体实施例对本发明技术方案作进一步详细说明。

实施例

本实施例为MiR-1909-5p对血管内皮细胞铁死亡和主动脉夹层的调控研究：

1、实验方法

1.1临床样本

收集10例自2021年4月至2022年3月在青岛大学附属医院行主动脉切除术的有长期吸烟史(吸烟指数≥300，吸烟指数＝每天吸烟支数×吸烟年数)的AD患者的主动脉组织作为疾病组。收集11例无长期吸烟史(无吸烟史或戒烟>3个月)且无AD的行胃肠肿瘤切除术患者的瘤旁正常动脉作为健康对照组。将获取的血管组织剥离干净并用预冷的1×PBS缓冲液清洗1-2次。预留部分组织以4％多聚甲醛固定及石蜡包埋后以备病理学染色，剩余组织将快速保存在液氮中以备分子学检测。临床组织的收集经青岛大学附属医院伦理委员会批准，患者或其法定监护人签署了知情同意书。

1.2AD小鼠模型的构建及治疗研究

(1)由济南朋悦实验动物繁育有限公司购进44只满3周龄的C57BL/6J雄性小鼠，在青岛大学转化医学研究院动物实验平台饲养。动物房采用自动照明控制系统，每天给予规律的12h光照，提供充足且新鲜的饮食供其自由获取，每2天称重一次。

(2)新购进的小鼠给予1周的标准饮食以适应环境后被随机分为4组，每组11只:saline组、AD模型组、AD+miR-1909-5p antagomir NC组和AD+miR-1909-5p antagomir组。对后3组小鼠同时诱导AD。具体方法为：腹腔注射血管紧张素Ⅱ(AngⅡ,6mg/kg/12h)和β-氨基丙腈(BAPN,0.33g/kg/24h)联合皮下注射尼古丁(30μg/kg/d)，saline组小鼠腹腔注射联合皮下注射生理盐水(200μl/d)。同时，两核酸治疗组小鼠尾静脉注射甲氧基丙醛PEG和miR-1909-5p antagomir NC或miR-1909-5p antagomir的混合物(2次/周，0.625mg/kg),saline组小鼠尾静脉注射等量的生理盐水(200μl/d)。MiR-1909-5pantagomir NC和miR-1909-5p antagomir由上海吉玛制药技术有限公司提供(miR-1909-5p antagomir正义链如SEQ ID NO：2所示；miR-1909-5p antagomir反义链RU SEQ ID NO：3所示。MiR-1909-5pantagomir NC序列：ACGCAGCAGAGCGUCGCCACG)。

(3)期间对死亡小鼠立即取主动脉进行观察和拍照。14天后对尚存活小鼠进行小动物超声成像观察主动脉。第15d处死小鼠，剥离并收集主动脉，进行分子检测和组织学分析。动物实验经青岛大学附属医院动物伦理委员会批准。实验过程中记录的各组小鼠死亡及存活数量见表1；

表1动物实验中小鼠存活情况

1.3细胞转染

(1)miR-1909-5p mimics、miR-1909-5p inhibitor以及它们各自的阴性对照寡核苷酸均购自上海吉玛制药技术有限公司。寡核苷酸粉末在室温下以3000-4000RPM/min离心1min后，加入DEPC水溶解为20μM的工作液。当6孔板或12孔板的细胞汇合度达到60％-70％时，按照制造商的说明书将无血清培养基与LipofectamineTM 3000或寡核苷酸混匀，静置15min。所用的寡核苷酸碱基序列见表2；

表2细胞转染所用的RNA序列

(2)将静置后的LipofectamineTM 3000预混液与寡核苷酸预混液等体积混匀后，再与含FBS的培养基混匀，静置5min。

(3)吸弃培养基，将静置5min后的混液加入待转染孔中。转染6h后吸弃含转染试剂的培养基，加入新培养基。

1.4RNA提取

(1)对于细胞样品，以6孔板为例。将处理完毕的细胞用1×PBS润洗两遍后加入TRIzol(1ml/孔)，置于冰上裂解15min。移液枪反复吹打细胞，将细胞裂解液移至1.5ml EP管；对于组织样品，切取黄豆粒大小组织块至1.5ml EP管，管中加入1ml TRIzol和数粒研磨珠。使用高通量组织研磨仪研磨组织至匀浆。

(2)EP管中加入氯仿(200μl/管)，上下剧晃后于冰上静置2-3min；

(3)将EP管置于高速低温离心机中离心(4℃，12000RPM/min，15min)。可见RNA分层。吸取上层RNA(400μl/管)至新EP管，加入等量异丙醇(400μl/管)缓慢颠倒摇晃几次，于冰上静置15min；

(4)将EP管置于高速低温离心机中离心(4℃，12000RPM/min，10min)，吸弃上清，加入75％乙醇洗涤沉淀。高速低温离心机离心(4℃，12000RPM/min，10min)，如前弃上清、留沉淀及洗沉淀；

(5)吸弃残液，室温下干燥RNA沉淀。干燥完毕后加入适量DEPC水(RNA多：20μl；RNA少：10μl)冰上溶解30min；

(6)光吸收酶标仪测定RNA浓度。

1.5RNA逆转录

(1)miRNA第一链cDNA合成

使用miRNA第一链cDNA合成试剂盒。该试剂盒具体组分及操作方法见表3；

表3加尾法反转录体系的配制

反转录反应条件：37℃，60min；85℃，5min；4℃,∞。

(2)mRNA的逆转录

a.去除基因组DNA

在RNase-free离心管中配制如表4的反应混合液，反应条件：42℃2min；4℃,∞。

表4去除基因组DNA的反应体系

b.配制逆转录反应体系

向上步反应完毕的混液中加入的5×HiScript III qRT SuperMix(4μl/管)，混匀后反应，反应条件：37℃，15min；85℃，5s；4℃,∞。稀释模板cDNA。

1.6qRT-PCR

qRT-PCR所用的基因引物及其序列见表5，

表5qRT-PCR所用的引物序列

配制的20μl反应体系见表6，

表6qRT-PCR配制的反应体系

反应条件：95℃，30s；95℃,5s；60℃,30s。扩增次数：40cycle。

1.7WB

(1)蛋白质提取

a.对于细胞，加入配制的蛋白提取裂解液(高效RIPA：cocktail＝100:1)，冰上裂解15min。对于组织，加入蛋白提取裂解液和研磨珠，高通量组织研磨仪充分研磨至匀浆。

b.低温高速离心机离心裂解液，吸取上清至新EP管。

(2)BCA法测定蛋白浓度

BCA检测试剂盒测定蛋白浓度并确定上样量。加入5×loading后煮熟。

(3)电泳

将蛋白样品依次加入配制SDS-PAGE凝胶。设定电泳程序，启动电泳仪。

(4)转膜

甲醇激活PVDF膜。三明治夹浸入转膜液。夹内放海绵、滤纸、PVDF膜和胶后夹紧插入转膜槽中。盖上转膜槽盖，设定转膜程序，启动转膜仪。

(5)封闭与抗体孵育

5％的牛奶室温下封闭1-2h，一抗4℃过夜孵育，二抗室温孵育1h。

(6)显影及蛋白条带量化

启动显影程序，根据初始显影效果调节曝光时间，保存图片。

1.8免疫组织化学染色(IHC)

(1)脱蜡至水：石蜡切片依次浸入二甲苯-无水乙醇-85％乙醇-75％乙醇-双蒸水中各5min；

(2)抗原修复：微波炉95℃煮沸切片15min后自然冷却，1×PBS洗涤；

(3)灭活内源性过氧化氢酶：切片滴加3％ H

(4)血清封闭：切片滴加3％ BSA后室温封闭20min，1×PBS洗涤；

(5)一抗封闭：切片滴加一抗工作液后在湿盒中4℃过夜孵育；

(6)次日二抗工作液室温孵育1h。吸弃二抗，PBST洗涤；

(7)DAB显色反应：切片滴加DAB工作液后自来水冲洗终止显色；

(8)衬染：切片甩干水分，滴加苏木素复染6-10s后，自来水冲洗；

(9)脱水、透明、封片。

1.9免疫组织荧光(IHF)

(1)脱蜡复水：石蜡切片依次浸入二甲苯-无水乙醇-85％乙醇-75％乙醇-双蒸水中各5min；

(2)抗原修复：微波炉以中火8min-停火8min-中低火7min修复抗原；

(3)切片滴加5％ BSA封闭液后室温封闭1h；

(4)孵育一抗：切片滴加一抗工作液后室温1-2h或4℃冰箱过夜孵育；

(5)孵育二抗：荧光二抗工作液后在室温避光孵育1h；

(6)DAPI复染核：DAPI染液，室温避光孵育，再用1×PBS洗涤；

(7)封片镜检：用含荧光淬灭剂的封片液封片，激光共聚焦显微镜扫描。

1.10荧光原位杂交实验(FISH)

a.脱蜡复水：石蜡切片依次浸入二甲苯-无水乙醇-85％乙醇-75％乙醇-双蒸水中各5min；

b.低渗：将切片浸入预温至37℃的KCl低渗液，37℃水浴孵育40min；

c.烤片：打开烤箱设定温度为56℃，烤片20min；

d.将切片依次放入下列试剂中处理：2×SSC 2min、复合消化液8min；2×SSC2min；甲醛溶液10min；浓度梯度乙醇各2min(70％-80％-无水乙醇)；

e.避光滴加探针缓冲液(25μl/张)，盖上盖玻片：

f.打开水浴锅设定温度为75℃，切片置于该条件下变性7min；

g.烤箱温度调至40℃，切片置于该恒温烤箱中杂交过夜；

h.次日切片浸入以下试剂中：0.4×SSC、2×SSC和75％乙醇各3min；

i.切片在通风橱内晾干后滴加DAPI染液；

j.染核20min后荧光显微镜观察。

1.11苏木素-伊红染色(HE染色)

(1)脱蜡至水：石蜡切片依次浸入二甲苯-无水乙醇-85％乙醇-75％乙醇-双蒸水中各5min；

(2)浸染：苏木素浸染10min后用1％盐酸酒精分化。再用伊红浸染5min；

(3)脱水：将切片投入浓度梯度乙醇中脱水；

(4)透明：将切片分2次投入二甲苯中(5min/次)：

(5)封片：吸水纸吸干残余二甲苯，悬空滴加中性树胶封片，晾干。

1.12Masson染色

(1)脱蜡至水：石蜡切片常规脱蜡至蒸馏水；

(2)浸染：切片用Weigert氏铁苏木素染液浸染后用1％盐酸酒精分化。丽春红酸性品红、1％磷钼酸溶液和苯胺蓝液溶液浸染后用1％冰醋酸处理；

(3)脱水、透明、封片。

1.13Verhoeff-Van Gieson染色

脱蜡后的切片置于Verhoeff染色液中浸染30min后用Verhoeff染色液分化。再用Van Gieson染色液对切片进行染色(10s)。切片脱水、透明和密封。

1.14活性氧(ROS)含量检测

(1)装载探针：DCFH-DA工作液37℃孵育后用无血清培养基漂洗。

(2)荧光显微镜观察细胞内荧光，Image J量化荧光强度。

1.15还原型谷胱甘肽(GSH)含量检测

(1)收集细胞：贴壁细胞用胰酶消化后，收集细胞悬液、离心并洗涤细胞，每样品加120μl试剂一重悬细胞，超声波破碎。离心收集上清置冰上待测。

(2)取各样品上清用BCA法测定蛋白浓度；

(3)试剂二在37℃水浴锅中预热30min；

(4)试剂一10倍稀释后配制浓度梯度的标准品。1.5ml EP管中依次加入各浓度标准品或双蒸水、试剂二和试剂三后加至96孔板测定412nm处吸光度；

(5)绘制标准曲线：以各标准孔吸光度减去空白孔吸光度为横坐标浓度为纵坐标绘制标准曲线；

(6)测定样品吸光度：1.5ml EP管中依次加入样品、试剂二和试剂三后加至96孔板，检测412nm吸光度A2，△A＝A2-A1；

(7)GSH含量计算：将△A代入标准曲线的公式求出样本浓度y。最后代入GSH计算公式求出GSH含量。

1.16丙二醛(MDA)含量检测

(1)收集细胞：胰酶消化贴壁细胞、收集细胞悬液、离心并吸弃上清。每样品管加入提取液重悬细胞。超声波破碎细胞，离心收集上清置冰上待测。

(2)取各样品上清用BCA法测定蛋白浓度；

(3)测定样品吸光度：1.5ml EP管中依次加入200μl样品和双蒸水、200μl试剂三、600μl MDA检测工作液，混匀后将各管混合液置于金属浴中(95℃，90min)，冰浴中冷却，离心(常温，10000g，10min)。吸取上清液到96孔板(100μl/孔,每样品3个重复)，检测450nm、532nm、600nm处吸光度；

(4)MDA含量计算：按蛋白浓度：MDA含量(nmol/mg prot)＝5×(12.9×(△A532-△A600)-2.58×△A450)/Cpr(△A450＝A450样品-A450空白，△A532＝A532样品-A532空白，△A600＝A600样品-A600空白)。

1.17双荧光素酶报告基因实验

该实验所用试剂见表7(以200T为例)，

表7双荧光素酶报告酶基因检测试剂盒组分表

将各组分从冰箱取出并充分解融至室温，

(1)配制试剂

a.Luciferase Reaction Reagent

将Luciferase Reaction Buffer全部倒入Luciferase Reaction Substrate中，涡旋震荡充分溶解，分装至5ml离心管(外包锡纸)；

b.Luciferase Reaction ReagentⅡ

Luciferase Reaction BufferⅡ和Luciferase Reaction SubstrateⅡ(50×)按50:1稀释比稀释，分装至5ml离心管(外包锡纸)；

c.1×Cell Lysis Buffer

将5×Cell Lysis Buffer与高压蒸汽灭菌的双蒸水按4：1的稀释比稀释；

(2)裂解细胞

吸弃培养基，1×PBS洗涤细胞2次，加入1×Cell Lysis Buffer裂解10min，收集细胞裂解液，离心取上清备用；

(3)检测吸光度

吸取解融至室温的Luciferase Reaction Reagent加入96孔板中(100μl/孔)，再加入细胞裂解液(20μl/孔)，检测萤火虫荧光素酶报告基因的活性。后吸取解融至室温的Luciferase Reaction ReagentⅡ加入上述反应孔中(100μl/孔)，检测萤火虫荧光素酶报告基因的活性。

实验所用的转染质粒序列见表8；

表8双荧光素酶报告基因转染质粒序列

2、统计学分析

采集的所有原始数据均使用GraphPad Prism 8.3.0软件进行处理。计数资料以例数或百分比表示。计量资料以均数±标准差(SD)表示。两独立样本间比较采用非配对t检验。多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为有统计学意义。

3、实验结果

3.1长期吸烟的AD患者和尼古丁处理的AD小鼠主动脉内膜铁死亡的相关研究

为了探索铁死亡在吸烟AD患者主动脉损伤中的独特作用，首先检测了吸烟AD患者的主动脉中是否存在铁死亡。结果显示，吸烟AD患者主动脉中的铁死亡抑制物GPX4显著下调，而铁死亡驱动物ptgs2上调(图1中A)。上述结果初步证明铁死亡参与了吸烟相关的AD发生。接下来，采用IHC检测了吸烟AD患者主动脉中的GPX4(图1中B)。与正常动脉组织相比，夹层主动脉组织中的GPX4显著下调，并且GPX4在正常动脉内膜明显富集。IHF结果显示，与疾病组相比，健康组GPX4的荧光更强，并且GPX4也在健康动脉内膜丰富表达(图1中C)。在尼古丁处理的AD小鼠模型中，也在其主动脉内膜观察到类似的铁死亡现象(图1中D-F)。有趣的是，这一发现首次揭示了主动脉内膜铁死亡可促进AD进展。谷胱甘肽过氧化物酶(GPX4)是经典的内源性抗铁死亡硒蛋白，其可利用谷胱甘肽将脂质氢过氧化物(L-OOH)转化为还原型脂质醇(L-OH)。因此，选择GPX4作为研究的靶蛋白。随后检测了VSMCs、HUVECs、RAW 264.7和THP-1细胞中GPX4 mRNA水平。数据显示，GPX4的转录水平在HUVECs中最高(图1中G)；

图1中，(A)临床健康动脉和吸烟AD患者主动脉的GPX4和ptgs2的免疫印迹(左)和定量(n＝4)。(B)临床健康动脉和吸烟AD患者主动脉的横断面免疫组织化学(IHC)染色，比例尺＝50μm；Image J定量GPX4阳性染色(n＝3)。(C)临床健康动脉和吸烟的AD患者主动脉横断面代表性的免疫组织化学荧光(IHF)染色，比例尺＝50μm，Image J定量GPX4阳性染色(n＝3)。(D)健康小鼠和尼古丁处理的AD小鼠的主动脉的GPX4免疫印迹和定量(n＝4)。(E-F)健康小鼠和尼古丁处理的AD小鼠主动脉的横断面IHC和IHF染色。Image J量化GPX4阳性(n＝3)，比例尺＝200μm，50μm；红色＝GPX4，绿色＝CD31，蓝色＝DAPI。(G)QRT-PCR检测VSMCs、HUVECs、RAW264.7及THP-1细胞中GPX4的mRNA水平(n＝3)。ns表示无显著性差异性、*表示P<0.05、**表示P<0.01和***表示P<0.001。结果表明：主动脉内膜可发生铁死亡。

3.2尼古丁引起内皮细胞铁死亡的研究

为了模拟吸烟对血管的病理损伤，用尼古丁处理HUVECs。结果发现，时间和浓度梯度的尼古丁均引起GPX4显著下调(图2中A-D)。综合考虑尼古丁作用于HUVECs的时间和HUVECs的生长密度，选择10-3M尼古丁处理HUVECs24h作为HUVECs的处理条件。而铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)可增加HUVECs中尼古丁降低的GPX4(图2中E-F)；

图2中，(A-B)免疫印迹检测10-6-10-2M的尼古丁处理HUVECs 24h后GPX4的表达(n＝3)。(C-D)10-3M尼古丁以时间梯度0h、24h、48h、72h处理HUVECs后GPX4的免疫印迹和量化(n＝3)。(E-F)免疫印迹检测10-3M尼古丁与或不与铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(100μM)共处理HUVECs 24h后GPX4的表达，F图为E图的量化(n＝3)。ns表示无显著性差异性、*表示P<0.05、**表示P<0.01和***表示P<0.001。

结果表明，尼古丁可诱导HUVECs铁死亡。同时建立了一种吸烟引发的内膜铁死亡细胞模型，为进一步的体外机制研究提供了便利。

3.3MiR-1909-5p靶向调控内皮细胞的GPX4的研究

为寻找调控GPX4的上游miRNA，使用三大miRNA在线网站(miRDB,miRWalk,Targetscan)预测了GPX4上游的miRNA，取交集得到9个miRNA(图3中A)。在这9个候选miRNAs中，选择了在物种间相对保守、在心血管事件中尚未研究且与氧化应激呈强相关的miR-1909-5p(图3中B)。随后，合成了miR-1909-5-p mimics和inhibitor，并在HUVECs中验证了其高转染效率(图3中C)。同时，转染miR-1909-5p mimics和inhibitor后，GPX4的mRNA和蛋白水平也分别下调和上调(图3中D-F)。这些结果表明，miR-1909-5p可能作为GPX4的上游靶基因，调控其转录和翻译。根据网站预测的miR-1909-5p与GPX43'-UTR的结合位点，合成了GPX4 3’-UTR的野生型(WT)和突变型(Mut)质粒，通过双荧光素酶报告基因实验检测miR-1909-5p与GPX4 3'-UTR的结合情况(图3中G)。结果显示，共转染miR-1909-5p mimics和WT质粒组的发光强度明显低于共转染miR-1909-5p NC和WT质粒组。而共转染miR-1909-5pmimic和Mut质粒组与共转染miR-1909-5p NC和Mut质粒组间的发光强度无统计学意义。这成为miR-1909-5p靶向调控GPX4的直接证据。浓度梯度尼古丁处理HUVECs 24h后，miR-1909-5p的mRNA水平与GPX4的mRNA水平也呈现出相反的趋势(图3中H)。这也间接说明miR-1909-5p可下调GPX4。为了研究miR-1909-5p在组织中的表达和定位，在动物和临床组织样本中进行了qRT-PCR和FISH结合IHF实验。结果显示，与健康小鼠主动脉相比，尼古丁处理的AD小鼠主动脉中miR-1909-5p的mRNA水平更高，miR-1909-5p的荧光更强并富集在主动脉内膜中(图3中I)。在临床样本中也观察到一致的结果(图3中J)。

图3中，(A)三大miRNA在线网站miRDB、miRWalk和Targetscan预测GPX4的上游miRNAs韦恩图。(B)miR-1909-5p在不同物种间的基因序列保守性比对结果。(C)QRT-PCR检测HUVECs转染miR-1909-5p模拟物和抑制物24h后的转染效率(n＝3)。(D)QRT-PCR检测HUVECs转染miR-1909-5p模拟物和抑制物24h后GPX4的mRNA水平(n＝3)。(E-F)HUVECs转染miR-1909-5p模拟物和抑制物24h后GPX4的免疫印迹(上)和量化(下，n＝3)。(G)上图为GPX43’-UTR野生型及突变型质粒的构建模式图，下图为双荧光素报告酶基因实验检测miR-1909-5p与GPX4的直接结合(n＝3)。(H)QRT-PCR检测浓度梯度尼古丁(10-7-10-3M)处理HUVECs 24h后miR-1909-5p(左)和GPX4(右)的mRNA水平(n＝3)。(I)QRT-PCR(左)及FISH联合IHF(右)检测健康小鼠和尼古丁处理的AD小鼠主动脉中的miR-1909-5p的表达(n＝3)，比例尺＝50μm，红＝miR-1909-5p，绿＝CD31，蓝＝DAPI。(J)QRT-PCR(左)及FISH联合IHF(右)检测临床健康动脉和吸烟AD患者主动脉的miR-1909-5p(n＝3)，比例尺＝50μm，红＝miR-1909-5p，绿＝CD31，蓝＝DAPI。n＝3,ns表示无显著性差异性、*表示P<0.05、**表示P<0.01和***表示P<0.001。

综上所述，miR-1909-5p可以结合GPX4并下调其在内皮细胞中的表达。

3.4过表达miR-1909-5p促进尼古丁诱导的内皮细胞铁死亡的研究

为了研究miR-1909-5p在病理条件下对内皮细胞铁死亡的调控作用，将miR-1909-5p mimics或其阴性对照NC转染至HUVECs并与尼古丁共处理HUVECs 24h。结果显示，转染miR-1909-5p mimics使尼古丁对GPX4的下调更加显著(图4中A-B)。ROS检测结果显示，过表达miR-1909-5p进一步增加了尼古丁刺激的ROS含量(图4中C-D)。经上述处理后，MDA与ROS的变化趋势一致(图5中E)。转染miR-1909-5p模拟物后，抗铁死亡标志物GSH的下调更显著，这进一步证实了过表达miR-1909-5p的促铁死亡作用(图4中F)。

图4中，(A)免疫印迹检测GPX4的表达。(B)柱状图为图1中A量化图(n＝3)。(C)ROS的免疫荧光显微照片，比例尺＝50μm。(D)柱状图为图1中C量化图(n＝3)。(E-F)MDA和GSH的产量(n＝3)。ns表示无显著性差异性、*表示P<0.05、**表示P<0.01和***表示P<0.001。

结果表明，过表达miR-1909-5p加重了尼古丁诱导的内皮细胞铁死亡。

3.5敲低miR-1909-5p抑制尼古丁诱导的内皮细胞铁死亡的研究

为了验证抑制miR-1909-5p后是否会减轻尼古丁诱导的铁死亡，HUVECs转染miR-1909-5p inhibitor或inhibitor NC，然后与尼古丁共孵育24h。WB实验表明在尼古丁处理的HUVECs中，敲低miR-1909-5p可抑制GPX4的下调(图5中A-B)。同时，转染miR-1909-5pinhibitor降低了HUVECs中尼古丁升高的ROS和MDA(图5中C-E)。此外，转染miR-1909-5pinhibitor增加了HUVECs中尼古丁降低的GSH(图5中F)。

图5中，(A)免疫印迹检测GPX4的表达。(B)柱状图为图1中A量化图(n＝3)。(C)ROS的免疫荧光显微照片，比例尺＝50μm。(D)柱状图为图1中C量化图(n＝3)。(E-F)MDA和GSH的产量(n＝3)。n＝3,ns表示无显著性差异性、*表示P<0.05、**表示P<0.01和***表示P<0.001。

结果表明，敲低miR-1909-5p可抑制尼古丁诱导的内皮细胞铁死亡。

3.6在尼古丁处理的AD小鼠中，敲低miR-1909-5p通过抑制主动脉内膜铁死亡而减轻AD的研究

为了进一步探究敲低miR-1909-5p是否可通过抑制铁死亡而缓解吸烟相关的AD，构建了尼古丁处理的AD小鼠模型。首先，小鼠腹腔注射AngⅡ和BAPN联合皮下注射尼古丁。同时，小鼠尾静脉注射miR-1909-5p antagomir及其阴性对照antagomir NC。14天后对小鼠进行安乐死取主动脉。生存曲线显示，抑制miR-1909-5p可明显降低小鼠的死亡率(图6中A)。敲低miR-1909-5p也减轻了小鼠的AD病变并降低了AD的发病率(图6中B-C)。小鼠主动脉超声图显示，miR-1909-5p antagomir治疗后，AD小鼠的主动脉直径明显变小(图6中D)。主动脉直径大体测量结果与上述结果一致(图6中E)。此外，H&E染色显示，抑制miR-1909-5p后，AD小鼠的主动脉厚度减少，主动脉各层排列更加规则(图6中F)。Masson染色表明敲低miR-1909-5p减少了AD小鼠主动脉断裂的胶原纤维(图6中G)。EVG染色进一步证实了miR-1909-5p antagomir可维持AD小鼠弹性纤维的完整性(图7中H)。结果表明，下调miR-1909-5p减缓了吸烟相关的AD的进展。接着也检测了各处理组的铁死亡。数据表明，miR-1909-5pantagomir治疗后，主动脉内膜中的miR-1909-5p下调(图7中I)而GPX4上调(图8中J-K)。MDA检测结果进一步证实，敲低miR-1909-5p可抑制主动脉铁死亡(图8中L)。

图6、图7和图8中，(A)各处理组小鼠的生存曲线。(B)各处理组小鼠的主动脉大体照片。(C)各处理组小鼠的AD发生率。(D-E)超声(D)及大体(E)测量小鼠的主动脉直径(n＝5)。(F-G)小鼠主动脉横切面的H&E染色图(F)和Masson(G)染色图，比例尺＝200μm。(H)小鼠主动脉横切面的EVG染色(左)及弹性纤维断裂数(右，n＝5)。比例尺＝200μm。(I)各处理组小鼠主动脉横切面中miR-1909-5p的FISH荧光图，比例尺＝50μm，红＝miR-1909-5p，绿＝CD31，蓝＝DAPI。(J)不同处理组小鼠主动脉的免疫印迹(左)及量化(右，n＝3)。(K-L)各处理组小鼠主动脉中GPX4的IHC(K)及MDA含量(L，n＝3)，比例尺＝200μm。ns表示无显著性差异性、*表示P<0.05、**表示P<0.01和***表示P<0.001。

结果表明，动物实验结果表明抑制miR-1909-5p缓解了吸烟相关的AD，这种保护作用是通过抑制主动脉内膜的铁死亡实现的。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。