一种检测克里米亚-刚果出血热病毒的引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒

摘要

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测克里米亚‑刚果出血热病毒的引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒。采用本发明提供的引物探针组合物检测克里米亚‑刚果出血热病毒，具有较好的灵敏度和准确度，扩增效率高，且操作简便，快速省时。本发明利用一体化芯片上微流控的方式集成了核酸提取、纯化、扩增和检测，解决病原体快速检测的问题，实现“样本进‑结果出”的POCT检测方案，取样后直接加入设备，纯化加扩增，60分钟内出结果。

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测克里米亚-刚果出血热病毒的引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒。

背景技术

克里米亚-刚果出血热(Crimean–Congo hemorrhagic fever，CCHF)是一种病毒性疾病。克里米亚-刚果出血热的症状可能包括发烧、肌肉疼痛、头痛、呕吐、腹泻和皮肤出血。暴露后不到两周就会出现症状。并发症可能包括肝功能衰竭。在那些存活下来的人中，恢复通常发生在发病后两周左右。克里米亚-刚果出血热病毒通常通过蜱虫叮咬或与携带该疾病的牲畜接触传播。感染风险高的群体是农民和在屠宰场工作的人。该病毒还可以通过体液在人与人之间传播。

该病毒于1940年代在克里米亚首次观察到，后来被确定为与刚果出血热相同的病原体。

如何在边境检验检疫中快速筛查相关病原体变得越来越重要。传统检测方法如病毒分离培养，其操作复杂，检测周期长；抗原检测和血清学检测等免疫法的特异性高，但灵敏度较低，且不能用于疾病的早期诊断。实时荧光定量PCR 技术是目前应用最广泛的分子检测法，该技术具有灵敏度高、特异性强、自动化程度高等特点。但是许多设备体积较大，并且样本通常需要前处理，对实验条件要求相对较高，不适合现场检测。

本申请人基于以上问题，经过数年研发，于在先申请CN202110057507.0中公开了一种新型现场化快速核酸检测设备CarryOn P1000Q，该设备为“手持全自动封闭式核酸qPCR分析系统”，可在60分钟内完成相关病原体的现场自动化核酸检测，能够实现“样品进，结果出”的快速检测。本申请即在该技术的基础上进一步研发出的，能够更好的配合该设备的试剂类发明，即检测克里米亚-刚果出血热病毒的一体化微流控芯片试剂盒。

现有的检测试剂盒及方法操作时间长，且操作步骤繁琐，因此，亟需提供一种灵敏度高、特异性强、覆盖面广、操作简便、省时且节约成本的检测克里米亚-刚果出血热病毒的试剂盒及其使用方法。

发明内容

为了解决现有技术中的上述问题，本申请提供了一种检测克里米亚-刚果出血热病毒的引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒。采用本发明所述的引物探针组合物可检测克里米亚-刚果出血热病毒，具有较好的灵敏度和准确度，扩增效率高，且操作简便，快速省时。

为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一方面，本发明提供了一种检测克里米亚-刚果出血热病毒的引物探针组合物，所述的引物探针组合物包括检测克里米亚-刚果出血热病毒的引物探针组合物和检测内参的引物探针组合物。

具体地，所述的检测克里米亚-刚果出血热病毒的引物探针组合物包括CCHF引物探针组合物。

具体地，所述的检测内参的引物探针组合物为IPC引物探针组合物。

进一步具体地，

(1)所述的CCHF引物探针组合物为：

F：SEQ ID NO:1：5'-GGAGTTTGTCAAAGGCAAATACAT-3'；

R：SEQ ID NO:2：5'-CTGTTGCAACAAGTGCTATTCC-3'；

P：SEQ ID NO:3：5'-CGGCCTGACTTGTTGATGTCCCC-3'；

(2)所述的IPC引物探针组合物为：

F：SEQ ID NO:4：5'-AGTTGCAGTGTAACCGTCATGTA-3'；

R：SEQ ID NO:5：5'-TCGACGAGACTCTGCTGTTAA-3'；

P：SEQ ID NO:6：5'-CAGTAATCTGCGTCGCACGTGTGCA-3'。

具体地，所述的检测克里米亚-刚果出血热病毒的引物探针组合物用于检测克里米亚-刚果出血热病毒的S基因。

具体地，所述探针的5'端标记有荧光报告基团，所述探针的3'端标记有淬灭基团；所述荧光报告基团为CY3、CY5、CY5.5、FAM、HEX、VIC、JOE或ROX中的一种或多种，所述淬灭基团为荧光淬灭基团。

进一步具体地，所述的检测克里米亚-刚果出血热病毒的探针5’端荧光报告基团为FAM， 3’端淬灭基团为BHQ1；所述的检测内参IPC的探针5’端荧光报告基团为CY5，3’端淬灭基团为BHQ3。

另一方面，本发明提供了上述引物探针组合物在制备检测克里米亚-刚果出血热病毒产品中的应用。

具体地，所述的产品包括但不限于独立试剂、芯片或试剂盒。

又一方面，本发明提供了一种检测克里米亚-刚果出血热病毒的产品，所述的产品包括上述引物探针组合物。

具体地，所述的产品包括但不限于独立试剂、芯片或试剂盒。

具体地，所述的产品还包括纯化试剂、风干RT-qPCR反应试剂和冻干IPC过程质控品。

进一步具体地，所述的纯化试剂包括裂解液、洗脱液和磁珠，所述的裂解液包括盐酸胍、醋酸钠和Triton X-100，所述的洗脱液包括Tris-HCl，所述的裂解液和洗脱液的体积比为1:2-2.5，所述的磁珠为干化磁珠。

进一步具体地，所述的裂解液包括6M盐酸胍、0.4M醋酸钠(pH 4.7)和2％TritonX-100，所述的洗脱液包括10mM Tris-HCl(pH 8.5)。

进一步具体地，所述的冻干IPC过程质控品的序列为SEQ ID NO:7。

进一步具体地，所述的冻干IPC过程质控品是RNA假病毒。

进一步具体地，所述的冻干IPC过程质控品还包括甘露醇、海藻糖、牛血清白蛋白、消泡剂、2-羟丙基-β-环糊精、Tris-HCl(pH 8.0)、NaCl和Tween20。

进一步具体地，所述的冻干IPC过程质控品以冻干球的形式封装在一体化微流控芯片中。

又一方面，本发明还提供了一种检测克里米亚-刚果出血热病毒的一体化微流控芯片试剂盒，所述的试剂盒包括上述引物探针组合物。

具体地，所述的产品还包括纯化试剂、风干RT-qPCR反应试剂和冻干IPC过程质控品。

进一步具体地，所述的纯化试剂包括裂解液、洗脱液和磁珠，所述的裂解液包括盐酸胍、醋酸钠和Triton X-100，所述的洗脱液包括Tris-HCl，所述的裂解液和洗脱液的体积比为 1:2-2.5，所述的磁珠为干化磁珠。

进一步具体地，所述的裂解液包括6M盐酸胍、0.4M醋酸钠(pH 4.7)和2％TritonX-100，所述的洗脱液包括10mM Tris-HCl(pH 8.5)。

进一步具体地，所述的冻干IPC过程质控品的序列为SEQ ID NO:7。

进一步具体地，所述的冻干IPC过程质控品是RNA假病毒。

进一步具体地，所述的冻干IPC过程质控品还包括甘露醇、海藻糖、牛血清白蛋白、消泡剂、2-羟丙基-β-环糊精、Tris-HCl(pH 8.0)、NaCl和Tween20。

进一步具体地，所述的冻干IPC过程质控品以冻干球的形式封装在一体化微流控芯片中。

具体地，所述的试剂盒在一体化芯片上完成样本的核酸提取、纯化、扩增和检测。

具体地，所述的微流控芯片试剂盒可用于CarryOn P1000Q快速核酸检测设备。

又一方面，本发明提供了上述引物探针组合物、产品或试剂盒在检测克里米亚-刚果出血热病毒中的应用。

又一方面，本发明提供了一种检测克里米亚-刚果出血热病毒的方法，所述的方法为非疾病诊断和治疗方法，所述的方法包括利用上述引物探针组合物、产品或试剂盒对待测样本中克里米亚-刚果出血热病毒进行检测。

具体地，所述的方法包括以下步骤：

(1)利用上述纯化试剂提取样本的RNA并进行纯化；

(2)利用上述引物探针组合物扩增步骤(1)提取并纯化的样本RNA；

(3)对扩增结果进行分析。

进一步具体地，上述步骤采用CarryOn P1000Q快速核酸检测设备，在一体化微流控芯片上进行。

与现有技术相比，本发明提供的试剂盒具有如下有益效果：

(1)采用本发明提供的引物探针组合物可检测克里米亚-刚果出血热病毒，具有较好的灵敏度和准确度，扩增效率高，且操作简便，快速省时。

(2)利用一体化芯片上微流控的方式解决病原体快速检测的问题，实现“样本进-结果出”的POCT检测方案，取样后直接加入设备，集成核酸的提取、纯化、扩增和检测，60分钟内出结果。

附图说明

图1为试剂盒灵敏度检测结果图。

图2为试剂盒重复性检测结果图。

图3为试剂盒特异性检测结果图，其中，A为裂谷热病毒S基因特异性检测结果，B为人基因组特异性检测结果，C为大肠杆菌基因组特异性检测结果。

图4为一体化微流控芯片正反面实物图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例中未注明具体技术或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件(如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。

1.试剂及仪器

(1)本申请所用的试剂信息详见下表1。

表1试剂及厂家

(2)本申请所用的仪器信息详见下表2。

表2仪器及厂家

本申请所用的整体设备即PCR反应装置详见专利202110057507.0，用于核酸检测的芯片装置详见202110055537.8。

实施例1.一种检测克里米亚-刚果出血热病毒的引物探针组合物

所述的引物探针组合物包括检测克里米亚-刚果出血热病毒的引物探针组合物和检测内参的引物探针组合物。

所述的检测克里米亚-刚果出血热病毒的引物探针组合物为CCHF引物探针组合物。

所述的检测内参的引物探针组合物为IPC引物探针组合物。

(1)所述的CCHF引物探针组合物为：

F：SEQ ID NO:1：5'-GGAGTTTGTCAAAGGCAAATACAT-3'；

R：SEQ ID NO:2：5'-CTGTTGCAACAAGTGCTATTCC-3'；

P：SEQ ID NO:3：5'-CGGCCTGACTTGTTGATGTCCCC-3'；

(2)所述的IPC引物探针组合物为：

F：SEQ ID NO:4：5'-AGTTGCAGTGTAACCGTCATGTA-3'；

R：SEQ ID NO:5：5'-TCGACGAGACTCTGCTGTTAA-3'；

P：SEQ ID NO:6：5'-CAGTAATCTGCGTCGCACGTGTGCA-3'。

本申请所述的克里米亚-刚果出血热病毒的引物探针组合物用于检测克里米亚-刚果出血热病毒的S基因。

实施例2一种检测克里米亚-刚果出血热病毒的一体化微流控芯片试剂盒

(1)包括实施例1所述的引物探针组合物，各引物浓度均为0.4μM，探针浓度均为0.2μM。

(2)还包括纯化试剂、风干RT-qPCR反应试剂和冻干IPC过程质控品。

1)所述的纯化试剂包括裂解液400μL和洗脱液850μL，磁珠15μL，所述的裂解液包括 6M盐酸胍、0.4M醋酸钠(pH 4.7)和2％Triton X-100，所述的洗脱液包括10mM Tris-HCl(pH 8.5)，将纯化试剂加入芯片中的加样层，所述的磁珠干化方法见专利202110222434.6。

2)所述风干RT-qPCR反应试剂体系如下表3所示。

表3风干RT-qPCR反应试剂体系

将上述表3试剂加入一体化微流控芯片的反应仓中，将芯片放入鼓风干燥箱，按照Air-Dryable 1-Step RT-qPCR Mix说明书进行风干操作。

3)所述冻干IPC过程质控品包括IPC假病毒的制备和冻干试剂体系。

按照专利CN202110669475.X实施例1所述的假病毒的制备方法，构建并得到IPC基因 (SEQ ID NO:7)的假病毒。

所述冻干IPC试剂体系如下表4所示。

表4冻干IPC试剂体系

将上述表4试剂每5μL滴到液氮中制成冻干球，放入西林瓶中按照表5的冷冻干燥机冻干程序进行冻干。

表5冻干程序

将冻干IPC过程质控品放入已风干反应试剂的芯片上，组装成一体化检测试剂盒。

实施例3克里米亚-刚果出血热病毒检测试剂盒的使用方法

采用CarryOn P1000Q进行本申请所述的克里米亚-刚果出血热病毒的检测，具体检测步骤如下表6所示。

表6

实时定量PCR反应程序为：55℃10min；95℃1min；(95℃10s，60℃20s)，45cycles。

实验例1灵敏度检测

按照专利CN202110669475.X实施例1所述的假病毒的制备方法，分别构建并得到包含 CCHF的S基因片段(Genbank：NC_005302.1:500-1000bp，SEQ ID NO:8)的假病毒，通过ddPCR对假病毒纯化后的RNA进行定量后，调整投入量为5×10

表7

由上表7可知，本申请所述的引物组合物及其试剂盒具有较好的灵敏度，可对5×10

实验例2准确性检测

按照专利CN202110669475.X实施例1所述的假病毒的制备方法，分别构建并得到包含 CCHF的S基因片段(Genbank：NC_005302.1:500-1000bp，SEQ ID NO:8)的假病毒，通过ddPCR对假病毒纯化后的RNA进行定量后，调整其浓度为每个反应(样本体积200μL)1×10

表8

由表8可知，本申请所述的引物组合物及其试剂盒具有较好的重复性，且100拷贝的假病毒投入量也可以稳定检出，设备结果扩增曲线图见图2。

实验例3特异性检测

使用人全基因组，大肠杆菌全基因组和裂谷热病毒S基因体外转录RNA对试剂盒做特异性测试。其中所有样本体积均为200μL。人基因组和大肠杆菌基因组的投入量为1μg。裂谷热病毒的S Segment(Genbank：NC_014395.1)委托北京擎科生物科技有限公司进行全基因合成，阳性质粒使用pET28a载体，使用Thermo Scientific TranscriptAid T7 HighYield Transcription Kit(货号K0441)进行体外转录实验，体外转录RNA使用Qubit 4.0对单链RNA 进行定量，特异性检测实验中裂谷热病毒S基因RNA投入量为5×10

按照上述实施例1-3的体系和步骤对上述提取的样品进行检测，其检测结果如下表9所示。

表9

其中，裂谷热病毒S基因体外转录RNA、人基因组和大肠杆菌基因组检测结果Ct值为内参扩增结果。本申请所述的克里米亚-刚果出血热病毒引物探针组合物未扩增到产物。因此，其检测结果为阴性。

其检测结果图如图3所示，由上表9可知，本申请所述的引物组合物及其试剂盒具有较好的特异性。

以上仅为本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京中科生仪科技有限公司

<120> 一种检测克里米亚-刚果出血热病毒的引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

ggagtttgtc aaaggcaaat acat 24

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

ctgttgcaac aagtgctatt cc 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

cggcctgact tgttgatgtc ccc 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

agttgcagtg taaccgtcat gta 23

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

tcgacgagac tctgctgtta a 21

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

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<400> 6

cagtaatctg cgtcgcacgt gtgca 25

<210> 7

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

agttgcagtg taaccgtcat gtaccagtaa tctgcgtcgc acgtgtgcac ctagtctaat 60

cacttatgac tcagataact taacagcaga gtctcgtcga 100

<210> 8

<211> 501

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

agcaacaaag tcctcgcaga atacaaagtc cctggtgaga ttgtgatgtc tgtcaaagag 60

atgctgtcag acatgattag gagaaggaac ctgattctaa acaggggtgg tgatgagaac 120

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tacatcatgg ccttcaaccc accatggggg gacatcaaca agtcaggccg ttcaggaata 240

gcacttgttg caacaggcct tgctaagctt gcagagactg aaggaaaggg aatatttgat 300

gaagccaaaa agactgtgga ggccctcaac gggtatctgg acaagcataa ggacgaagtt 360

gatagagcaa gcgccgacag catgataaca aaccttctta agcatattgc caaggcacag 420

gagctctata aaaattcatc tgcacttcgt gcacaaagcg cacagattga cactgctttc 480

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