用于神经节细胞研究的动物模型的构建方法以及神经节细胞类型的区分方法

摘要

本申请提供了一种用于神经节细胞研究的动物模型的构建方法，包括：将第一目标动物与第二目标动物交配，得到杂合一代动物，所述第一目标动物的光感受器退化，所述第二目标动物携带LSL识别位点和荧光蛋白基因；将第一病毒悬液和第二病毒悬液注入所述杂合一代动物的玻璃体中，获得动物模型，其中，所述第一病毒悬液包括携带Cre重组酶基因的病毒，所述第二病毒悬液包括携带钙指示剂基因的病毒。该构建方法简单，操作方便，获得的动物模型的光感受器退化且具有多种标记物，能够用于神经节细胞类型的区分中，有利于视觉假体中电刺激参数的选择，以获得适用于光感受器退化的视觉假体。本申请还提供了一种神经节细胞类型的区分方法。

说明书

技术领域

本申请属于生物医学技术领域，具体涉及用于神经节细胞研究的动物模型的构建方法以及神经节细胞类型的区分方法。

背景技术

通过植入视觉假体来重建视觉是一种技术尖端且已被临床验证可长期有效恢复基本视觉的解决方案，它以微电子器件为核心，通过植入微电极阵列刺激视觉通路上的神经节细胞等，从而将外部图像信息转换成特定神经冲动传递到视觉中枢。神经节细胞根据对光刺激响应模式的不同可以分为ON型和OFF型，分别对光强度的增加和减少做出反应；若不同类型的神经节细胞能够在所需的时间或空间被选择性激活，则视觉假体可以引发更贴近生理学的神经活动。目前视觉假体的电刺激方式均针对于正常的神经节细胞，当视网膜退行性疾病发生时，视觉通路前端的光感受器退化，现有的电刺激方式已不合适。因此，如何对光感受器退化的神经节细胞类型进行区分，是视觉假体应用中急需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本申请提供了一种用于神经节细胞研究的动物模型的构建方法以及神经节细胞类型的区分方法，该动物模型的光感受器退化且具有多种标记物，能够用于神经节细胞类型的区分中，有利于视觉假体中电刺激参数的选择，以获得适用于光感受器退化的视觉假体。

第一方面，本申请提供了一种用于神经节细胞研究的动物模型的构建方法，包括：

将第一目标动物与第二目标动物交配，得到杂合一代动物，所述第一目标动物的光感受器退化，所述第二目标动物携带LSL识别位点和荧光蛋白基因；

将第一病毒悬液和第二病毒悬液注入所述杂合一代动物的玻璃体中，获得动物模型，其中，所述第一病毒悬液包括携带Cre重组酶基因的病毒，所述第二病毒悬液包括携带钙指示剂基因的病毒。

可选的，所述第一病毒悬液的滴度大于或等于5×10

可选的，所述第一病毒悬液的注入量为25μl/kg-100μl/kg，所述第二病毒悬液的注入量为25μl/kg-100μl/kg。

可选的，所述携带Cre重组酶基因的病毒中病毒载体具有Nefh启动子。

可选的，所述荧光蛋白包括红色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白和黄色荧光蛋白中的至少一种。

进一步的，所述红色荧光蛋白包括tdTomato、DsRed、TagRFP和mCherry中的至少一种。

进一步的，所述蓝色荧光蛋白包括EBFP、EBFP2、Azurite、mKalama1和mTagBFP中的至少一种。

进一步的，所述黄色荧光蛋白包括EYFP、Topaz、Venus、mCitrine和Ypet中的至少一种。

可选的，所述钙指示剂包括GCaMP1、GCaMP2、GCaMP3、GCaMP5、GCaMP6、GCaMP7、GCaMP-X和RCaMPs中的至少一种。

可选的，所述第一目标动物和所述第二目标动物分别选自小鼠、大鼠、兔、羊和猴中的至少一种。

可选的，所述病毒包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒和逆转录病毒中至少一种。

第二方面，本申请提供了一种神经节细胞类型的区分方法，包括：

将第一目标动物与第二目标动物交配，得到杂合一代动物，所述第一目标动物的光感受器退化，所述第二目标动物携带LSL识别位点和荧光蛋白基因；

将第一病毒悬液和第二病毒悬液注入所述杂合一代动物的玻璃体中，获得动物模型，其中，所述第一病毒悬液包括携带Cre重组酶基因的病毒，所述第二病毒悬液包括携带钙指示剂基因的病毒；

获取所述动物模型的视网膜样本，对所述视网膜样本进行电刺激并观测，获得第一观测结果；

采用乙酰胆碱转移酶抗体对所述视网膜样本进行孵育，加入荧光染料标记的抗IgG抗体后进行观测，获得第二观测结果；

根据所述第一观测结果和所述第二观测结果对神经节细胞的类型进行区分。

可选的，所述电刺激的参数包括刺激持续时间为200ms-300ms，刺激频率为1kHz-6.25kHz，刺激幅度为1μA-240μA。

可选的，所述荧光染料包括ALEXA Fluor系列染料、异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白和花青素中的至少一种。

本申请提供的一种用于神经节细胞研究的动物模型的构建方法，该构建方法简单，操作方便，获得的动物模型的光感受器退化且具有多种标记物，能够用于神经节细胞类型的区分中；本申请还提供了一种神经节细胞类型的区分方法，能够对光感受器退化的神经节细胞的类型加以区分，从而有利于视觉假体中电刺激参数的选择，有助于获得适用于光感受器退化的视觉假体。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

图1为本申请一实施方式提供的用于神经节细胞研究的动物模型的构建方法的流程示意图。

图2为本申请一实施方式提供的神经节细胞类型的区分方法。

图3为本申请一实施方式提供的显微镜结果图。

图4为本申请另一实施方式提供的显微镜结果图。

图5为实施例1提供用于神经节细胞研究的动物模型的构建方法的流程图。

图6为实施例2采用的电刺激的波形图。

具体实施方式

以下是本申请的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本申请的保护范围。

请参阅图1，为本申请一实施方式提供的用于神经节细胞研究的动物模型的构建方法的流程示意图，包括：

S101：将第一目标动物与第二目标动物交配，得到杂合一代动物，第一目标动物的光感受器退化，第二目标动物携带LSL识别位点和荧光蛋白基因。

S102：将第一病毒悬液和第二病毒悬液注入杂合一代动物的玻璃体中，获得动物模型，其中，第一病毒悬液包括携带Cre重组酶基因的病毒，第二病毒悬液包括携带钙指示剂基因的病毒。

神经节细胞根据对光刺激响应模式的不同可以分为ON型细胞和OFF型细胞，分别对光强度的增加和减少做出反应，目前临床上植入的视觉假体中使用电极的直径过大，导致每个电极同时刺激数十甚至几百个神经节细胞，ON型和OFF型神经节细胞在刺激过程中经常被同时激活，大大降低了视觉假体的分辨率；因此选择性激活不同类型的神经节细胞成为了视觉假体领域急需突破的瓶颈。例如，通过优化高频电刺激的波形，实现神经节细胞的选择性激活，但当光感受器退化时，神经节细胞的电生理特性发生变化，导致上述结果失去参考价值；并且目前常采用膜片钳记录的方式区分ON型和OFF型神经节细胞，一旦神经节细胞的电生理特性发生变化，理论上已无法通过电记录的方式进行区分，并且膜片钳记录的方式需要对细胞膜进行破坏，技术复杂且操作难度大，耗时耗力。因此，如何在光感受器退化的情况下区分不同类型的视网膜神经节细胞，从而进一步实现选择刺激成为了技术难点。本申请提供了的用于神经节细胞研究的动物模型的构建方法，通过构建具有多种标记物的动物模型，用于神经节细胞的研究中，从而能够对不同类型的神经节细胞加以区分，从而达到选择性刺激的目的，提高视觉假体的分辨率和质量。

在本申请中，第一目标动物的光感受器退化，第二目标动物携带LSL识别位点和荧光蛋白基因，获得的杂合一代动物的光感受器退化并且携带LSL识别位点(loxP-stop-loxP)和荧光蛋白基因，同时荧光蛋白基因位于LSL识别位点的下游，由于存在LSL识别位点，正常情况下第二目标动物和杂合一代动物无法表达荧光蛋白；通过注入携带Cre重组酶(cyclization recombinase)基因的病毒，在杂合一代动物体内表达Cre重组酶，Cre重组酶识别loxP位点，并发生重组，表达loxP下游的荧光蛋白基因，从而在杂合一代动物的细胞中产生了荧光蛋白；在电刺激过程，神经元放电时会爆发出一个短暂的钙离子浓度高峰，钙离子浓度能够表征神经元活动，通过注入携带钙指示剂基因的病毒，在杂合一代动物体内表达钙指示剂，能够在神经元放电时将钙离子浓度通过荧光强度表现出来，同时获得受到刺激的神经元的位置。

在本申请一实施方式中，提供loxP-stop-loxP片段，将荧光蛋白基因连接至loxP-stop-loxP片段的下游(LSL-荧光蛋白基因)后敲入动物体内，获得第二目标动物。

在本申请一实施方式中，荧光蛋白包括红色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白和黄色荧光蛋白中的至少一种。通过选用上述荧光蛋白，从而更好地对细胞进行染色。在一实施例中，红色荧光蛋白包括tdTomato、DsRed、TagRFP和mCherry中的至少一种。在另一实施例中，蓝色荧光蛋白包括EBFP、EBFP2、Azurite、mKalama1和mTagBFP中的至少一种。在又一实施例中，黄色荧光蛋白包括EYFP、Topaz、Venus、mCitrine和Ypet中的至少一种。

在本申请一实施方式中，第一目标动物和第二目标动物分别选自小鼠、大鼠、兔、羊和猴中的至少一种。在一实施例中，第一目标动物可以为rd1小鼠，第二目标动物可以为Ai14小鼠。

在本申请一实施方式中，病毒包括腺病毒、腺相关病毒(AAV)、慢病毒和逆转录病毒中至少一种。在一实施例中，病毒为AAV。

在本申请一实施方式中，携带Cre重组酶基因的病毒中病毒载体具有Nefh启动子。Nefh启动子是神经节细胞靶向启动子，从而使得在神经节细胞中产生Cre重组酶，进而使得神经节细胞中表达荧光蛋白，从而对神经节细胞进行特异性标记。在一实施例中，荧光蛋白为tdTomato，在注入第一病毒悬液后，神经节细胞表达tdTomato，产生红色荧光。

在本申请一实施方式中，第一病毒悬液的滴度大于或等于5×10

在本申请一实施方式中，第一病毒悬液的注入量为25μl/kg-100μl/kg。可以理解的，其中kg为杂合一代动物的体重。进一步的，第一病毒悬液的注入量为30μl/kg-70μl/kg。具体的，第一病毒悬液的注入量可以但不限于为30μl/kg、40μl/kg、45μl/kg、50μl/kg或60μl/kg等。

在本申请一实施方式中，钙指示剂包括GCaMP1、GCaMP2、GCaMP3、GCaMP5、GCaMP6、GCaMP7、GCaMP-X和RCaMPs中的至少一种。在一实施例中，钙指示剂为GCaMP6，GCaMP6敏感性优异，可以准确反馈受刺激的神经元的位置，保证后续神经元细胞类型区分的准确性。可以理解的，荧光蛋白和钙指示剂均能够在荧光光照下产生颜色，为了更好地实现神经节细胞的区分，荧光蛋白和钙指示剂在荧光光照下的颜色不同。

在本申请一实施方式中，第二病毒悬液的滴度大于或等于1×10

在本申请一实施方式中，第二病毒悬液的注入量为25μl/kg-100μl/kg。进一步的，第二病毒悬液的注入量为30μl/kg-70μl/kg。具体的，第二病毒悬液的注入量可以但不限于为30μl/kg、40μl/kg、45μl/kg、50μl/kg或60μl/kg等。

本申请提供的一种用于神经节细胞研究的动物模型的构建方法，该构建方法简单，操作方便，获得的动物模型的光感受器退化且具有多种标记物，能够用于神经节细胞类型的区分中。

请参阅图2，为本申请一实施方式提供的神经节细胞类型的区分方法，包括：

S201：将第一目标动物与第二目标动物交配，得到杂合一代动物，第一目标动物的光感受器退化，第二目标动物携带LSL识别位点和荧光蛋白基因。

S202：将第一病毒悬液和第二病毒悬液注入杂合一代动物的玻璃体中，获得动物模型，其中，第一病毒悬液包括携带Cre重组酶基因的病毒，第二病毒悬液包括携带钙指示剂基因的病毒。

S203：获取动物模型的视网膜样本，对视网膜样本进行电刺激并观测，获得第一观测结果。

S204：采用乙酰胆碱转移酶抗体对视网膜样本进行孵育，加入荧光染料标记的抗IgG抗体后进行观测，获得第二观测结果。

S205：根据第一观测结果和第二观测结果对神经节细胞的类型进行区分。

视网膜主体由三层神经细胞的胞体和两层由突触组成的网状结构组成，从眼球内部往外依次是神经节细胞层、内网层、内核层、外网层、外核层，神经节细胞层分布着神经节细胞，内核层细胞分布着双极细胞，神经节细胞和双极细胞的突起相互形成突触构成了外网层，ON型神经节细胞突触更靠近神经节细胞层，OFF型神经节细胞突触更靠近内核层，因此ON型与OFF型神经节细胞树突末端也分别靠近神经节细胞层与内核层，分别位于内网层亚层b与亚层a。本申请基于视网膜结构的天然分层，通过钙离子成像技术以及免疫荧光染色技术，对光感受器退化的动物的神经节细胞类型进行区分和判断，根据第一观测结果和第二观测结果区分神经节细胞的类型，有利于视觉假体选择性刺激参数的选择，同时该方法简单，操作方便，有助于视觉假体的分辨率和质量的提升。

在本申请中，动物模型的构建过程请参考上述相关描述，在此不再赘述。

在本申请一实施例中，获取动物模型的视网膜样本包括将动物模型处死后，取出眼球，打开角膜并暴露晶体，移除晶体，打开巩膜，通过色素上皮完整剥离视网膜。可以理解的，进行电刺激和免疫染色的顺序不作限定，可以先进行电刺激过程，在加入乙酰胆碱转移酶抗体和荧光染料标记的抗IgG抗体，也可以先加入乙酰胆碱转移酶抗体和荧光染料标记的抗IgG抗体，再进入电刺激。

在本申请一实施例中，在电刺激前对视网膜样本进行观测。在一实施例中，采用双光子激光扫描显微镜系统对视网膜样本进行观测。可以理解的，由于细胞已经表达荧光蛋白，因此可以调节激发波长获得视网膜样本的观测结果。

在本申请一实施方式中，电刺激的参数包括刺激持续时间为200ms-300ms，刺激频率为1kHz-6.25kHz，刺激幅度为1μA-240μA。具体的，刺激持续时间可以但不限于为200ms、220ms、250ms、260ms、280ms、300ms等；刺激频率可以但不限于为1kHz、1.67kHz、2kHz、2.5kHz、3.33kHz、4.17kHz、5kHz、6.25kHz等；刺激幅度可以但不限于为1μA、5μA、20μA、50μA、100μA、120μA、150μA、200μA、220μA等。在一实施例中，在电刺激过程中，采用双光子激光扫描显微镜系统对视网膜样本进行观测，调节至钙指示剂对应的激发波长，进行观测。

在本申请中，视网膜星形无长突细胞是视网膜内唯一的胆碱能细胞，能够特异性的表达乙酰胆碱转移酶，因此利用乙酰胆碱转移酶抗体和荧光染料标记的抗IgG抗体对视网膜内网层进行标记，获得视网膜内网层的形态和结构。

在本申请一实施方式中，提供含乙酰胆碱转移酶抗体的母液，将母液进行稀释后对固定的细胞孵育即可。其中稀释倍数可以但不限于为10-100。在本申请一实施例中，提供含荧光染料标记的抗IgG抗体的母液，将母液进行稀释后对固定的细胞孵育即可。其中稀释倍数可以但不限于为10-800。

在本申请一实施方式中，荧光染料包括ALEXA Fluor系列染料、异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白和花青素中的至少一种。具体的，ALEXA Fluor系列染料包括ALEXA Fluor647、ALEXA Fluor 594、ALEXA Fluor 532、ALEXA Fluor 555等。在本申请中，荧光蛋白、钙指示剂和荧光染料均能够在荧光光照下产生颜色，为了更好地实现神经节细胞的区分，荧光蛋白、钙指示剂和荧光染料在荧光光照下的颜色不同。

请参阅图3，为本申请一实施方式提供的显微镜结果图，其中，白色区域为表达的荧光蛋白的区域，在该实施例中，显示出了神经节细胞的位置；深灰色区域为免疫荧光染色区域，在该实施例中，显示出了视网膜内网层的形态。请参阅图4，为本申请另一实施方式提供的显微镜结果图，其中，白色区域为钙指示剂显色位置，在该实施例中，显示出了受刺激的神经节细胞的位置和形态；深灰色区域为免疫荧光染色区域，在该实施例中，显示出了视网膜内网层的形态。

本申请提供的神经节细胞类型的区分方法是基于细胞形态学，对光感受器退化的神经节细胞的类型加以区分，从而有利于视觉假体中电刺激参数的选择，有助于获得适用于光感受器退化的视觉假体；其中Cre重组酶使荧光蛋白表达，同时在电刺激时利用钙离子成像机技术，显示了电信号在光感受器退化/损伤的神经节细胞中的传导通路，结合双光子共聚焦显微镜等光学工具，使分辨率达到细胞水平。

在本申请中，通过对神经节细胞的类型进行区分，进一步利用闭环算法(如Tianruo G,Yu Y C,David T,et al.Closed-Loop Efficient Searching of OptimalElectrical Stimulation Parameters for Preferential Excitation of RetinalGanglion Cells[J].Frontiers in Neuroence,2018,12:168-.)可以获得刺激ON型或OFF型细胞的最佳刺激参数，进而能够对神经节细胞进行选择性刺激，提高视觉假体的分辨率和质量。在一实施中，通过采用双向高频电刺激持续时间为300ms，设置刺激频率分别为1kHz、1.67kHz、2kHz、2.5kHz、3.33kHz、4.17kHz、5kHz、6.25kHz，刺激幅度范围为10μA-240μA，每次分别递进10μA且两次刺激间需要间隔足够长时间用于细胞状态恢复，阴极和阳极阶段的持续时长均为40μs，双向电流间没有时间间隔，来刺激神经节细胞，获得不同类型的神经节细胞的最佳刺激参数，从而能够获得视觉假体的电刺激参数，有利于提高视觉假体的分辨率和质量。

实施例1用于神经节细胞研究的动物模型的构建方法

将光感受器退化的rd1小鼠与带有LSL识别位点与tdTomato基因(LSL-tdTomato)的Ai14小鼠交配，获得Ai14-rd1小鼠。

从基因组DNA中扩增出小鼠2251bp的Nefh序列(NM_010904.3)，取代pAAV.CMV-Cre中的CMV启动子并获得携带Cre重组酶基因的病毒(AAV.Nefh-Cre)。选取5-6周大的Ai14-rd1小鼠，向其左眼玻璃体内注入1μL第一病毒悬液(5×10

向其左眼玻璃体内注入1μL第二病毒悬液(1×10

实施例2神经节细胞类型的区分方法

向实施例1制得的动物模型的腹腔注射50mg/kg氯胺酮麻醉后快速取出眼球后脱颈处死。在角膜边缘做一小切口后将眼球置于预先30min充有95％O

将视网膜样本迅速转移至装备有水浸物镜、Nikon荧光照明系统的显微镜镜台上。视网膜样本始终用NaHCO

选择直径为25μm的铂铱刺激电极，用微操纵器将其放置在距视网膜样本40μm处，利用刺激器为微电极提供电流。设置激发波长为920nm，采用阴极优先、电荷平衡的双向电流脉冲刺激，电刺激持续时间为300ms，刺激频率分别为1kHz、1.67kHz、2kHz、2.5kHz、3.33kHz、4.17kHz、5kHz、6.25kHz，刺激幅度范围为10μA-240μA，每次分别递进10μA且两次刺激间需要间隔足够长时间用于细胞状态恢复。阴极和阳极阶段的脉冲宽度(相位宽度)均为40μs，双向电流间没有时间间隔，刺激波形如图6所示。在显微镜的T-stack模式下进行拍照记录，帧频(frame rate)设置为5fps，获得电刺激结果。

采用4％的多聚甲醛固定液对视网膜样本固定1.5h后，用磷酸缓冲液(0.5％曲拉通X-100、0.1％NaN

在双光子显微镜下，在450nm波长再次拍照记录，获得免疫荧光检测结果。根据表达的红色荧光能够获知所有神经节的细胞形态以及位置，通过电刺激结果可以获知受刺激的该神经节细胞的位置，通过免疫荧光检测结果获得视网膜内网层的分层形态，根据受刺激的神经节细胞突触更靠近神经节细胞层还是内核层，从而获知电刺激的细胞为ON型细胞或OFF型细胞。

本申请通过构建动物模型，利用视网膜的天然结构分层，通过钙离子荧光成像、免疫染色成像、电刺激双光子图像采集的方式，对视网膜神经节细胞信号传导的技术的记录，避免了膜片钳记录的方式，保持了细胞完整性，降低了操作难度，避免了电学记录的伪迹等问题；同时能够对光感受器退化的神经节细胞类型加以区分，有利于视觉假体选择性刺激参数的优化，提高视觉假体的分辨率和仿生性能。

以上对本申请实施方式所提供的内容进行了详细介绍，本文对本申请的原理及实施方式进行了阐述与说明，以上说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。