一种提高海洋细菌对中肋骨条藻赤潮的溶藻效应的方法

摘要

本发明提供了一种提高海洋细菌对中肋骨条藻赤潮的溶藻效应的方法。活化培养交替单胞菌FDHY‑CJ后接种到一级种子培养基中培养，将获得的一级种子液接种在二级种子培养基中培养，再将获得的二级种子液接种在发酵培养基中于发酵罐中培养；所述一级种子培养基为2216E液体培养基；所述二级种子培养基配方为14.27 g/L蛋白胨，5 g/L可溶性淀粉，1.0 g/L酵母提取粉，0.01 g/L磷酸铁，30 g/L海盐，pH=7.2；所述发酵罐培养条件为：温度30℃，搅拌转速300 rpm，通气量6 L/min，装液量3 L/5L，接种量3%，罐压0.1MPa，培养时间12‑18 h。向中肋骨条藻液中添加1%的发酵液后24 h，其藻细胞数量减少率达到95%以上，与报道的常用培养方式比，藻细胞数量减少率提高了2.88倍，控藻效果提升显著。

说明书

技术领域

本发明属于环境微生物应用领域，具体地涉及一种提高海洋细菌对中肋骨条藻赤潮的溶藻效应的方法。

背景技术

中肋骨条藻是中国东部沿海常见的赤潮生物，在河口和营养盐比较丰富的海湾其数量较多，其是一种广温广盐性藻种，数量多且常见的硅藻，分布极广，是福建沿岸海域近年来分布最广泛的、细胞密度最大的赤潮生物。中肋骨条藻引发的赤潮可导致大西洋大马哈鱼的鱼鳃受损死亡。在经济海藻养殖区，中肋骨条藻经常与海带、紫菜等争夺营养，其大量增殖造成经济藻类变色，甚至腐烂而失去食用和商业价值。

目前，有关于赤潮的治理方法主要包括，物理法、化学法和生物法三大类。其中物理法和化学法治理赤潮费用昂贵，经济效益和环境效益均不友好。从发展趋势来看，生物法凭着环境友好，高效、快速且负面影响小等特点，成为赤潮治理的一个热门方向。其中溶藻菌是生物法治理赤潮中的重要工具，多数溶藻细菌能够分泌胞外物质，对宿主藻类起抑制或杀灭作用，因此利用溶藻细菌高效、专一且能够生物降解的杀藻特性成为治理赤潮的一个新的研究方向。

由于微生物的生长及其活性物质的生产受到其培养基成分和培养条件的直接影响，所以需要在原有的培养基基础之上重新找到一组新的、适合微生物生长和生产活性物质的培养基配方和培养条件。采用优化的培养基和培养条件不仅能够有效增强活性物质的产量，还能显著增加微生物的生物量，优化的培养基和培养条件还可以进一步扩大培养规模。与传统的摇瓶培养相比，发酵罐培养能够进一步扩大培养规模，达到规模化生产，并且在发酵罐培养过程中，进一步增强了微生物的生长密度和其活性物质的生产。近年来，研究者对于中肋骨条藻赤潮的爆发和防治中提出了一些治理方法，并且在赤潮水域中筛选出了一些能够杀灭中肋骨条藻的溶藻菌，然而这些溶藻菌的控藻能力不足以应对中肋骨条藻赤潮，因此亟需一种提高基于微生物防治中肋骨条藻赤潮的方法。目前国内外在藻类病毒和溶藻菌的基础理论方面研究较深入，但还停留在理论阶段尚未出现相关实用产品及技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高海洋细菌对中肋骨条藻赤潮的溶藻效应的方法，来解决现在利用溶藻菌应对中肋骨条藻赤潮时溶藻菌控藻能力不足、溶藻菌生物量和溶藻活性物质含量低以及溶藻菌不能规模化培养等问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种提高微生物防治中肋骨条藻赤潮性能的方法，包括如下步骤：培养基成分和培养条件优化、种子液培养、发酵罐培养；具体如下：

1.在2216E培养基的基础上添加不同的碳源和氮源，并筛选出最适合交替单胞菌FDHY-CJ生长和溶藻物质生产的碳源和氮源：可溶性淀粉和蛋白胨；

2.在含有优选的碳源和氮源培养基中，选择碳源含量、氮源含量、pH、温度、接种量、装液量、摇床转速、发酵时间8个因素进行Plackett-Burman实验，并筛选出影响交替单胞菌FDHY-CJ杀藻能力最显著的因素：蛋白胨含量、装液量和发酵时间；

3.将筛选出的能显著影响交替单胞菌FDHY-CJ杀藻能力的因素用于响应面分析，并将分析后得到的优化培养基配方和优化培养条件应用于种子液培养；

所述优化培养基配方为：14.27g/L蛋白胨，5g/L可溶性淀粉，1.0g/L酵母提取粉，0.01g/L磷酸铁，30g/L海盐，pH＝7.2；

所述优化培养条件为：温度30℃、装液量91.85ml/250ml、接种量2％(v/v)、转速150rpm、pH＝7.2、培养时间23h；

4.将冷冻保藏的交替单胞菌FDHY-CJ种进行平板培养，进一步挑取1-2个单菌落至一级种子摇瓶内培养，形成一级种子液，进一步吸取一级种子液以2％(v/v)的接种量接种至优化培养基内形成二级种子液；

所述平板培养为：培养基为2216E固体培养，其配方为：5.0g/L蛋白胨，1.0g/L酵母提取粉，0.01g/L磷酸铁，30g/L海盐，15g/L琼脂粉，pH＝7.2，121℃灭菌20-25min；培养条件为：置于25℃生化培养箱内培养24h；

所述一级种子液培养为：培养基为2216E液体培养基，其配方为：5.0g/L蛋白胨，1.0g/L酵母提取粉，0.01g/L磷酸铁，30g/L海盐，pH＝7.2，121℃灭菌20-25min；培养条件为：取50ml培养基装入100ml锥形瓶内，从平板上挑取1-2个菌落接种于一级种子摇瓶中的2216E液体培养基内，置于25℃，150rpm的摇床中培养24h；

所述二级种子液培养为：在优化培养基和优化培养条件下培养23h后的菌体单一、无杂菌的菌液；

5.将二级种子液接种于发酵罐内的优化培养基，通过控制发酵罐培养的部分参数达到交替单胞菌FDHY-CJ在罐内生长和杀藻活性物质生产最佳的培养工艺；

初始发酵罐培养条件为：温度30℃，搅拌转速150rpm，通气量3L/min，装液量3L/5L，罐压0.1MPa，培养时间72h。

所述发酵罐控制工艺包括如下：

a)控制不同接种量的操作，二级种子液的接种量设置为：1％(v/v)，2％(v/v)，3％(v/v)。5L发酵罐中的培养基灭菌后并降温至30℃时按照不同接种量将二级种子液接种至发酵罐中培养基内，在发酵罐初始培养条件下培养至72h，发酵过程中每隔6h取样，检测发酵过程中不同时间样品的OD

b)控制不同搅拌转速的操作，5L发酵罐的搅拌转速设置为：100rpm，150rpm，300rpm。5L发酵罐中的培养基灭菌后并降温至30℃时将二级种子液接种至发酵罐中培养基内，按照不同搅拌转速进行培养，其余培养条件按照发酵罐初始培养条件培养至72h，发酵过程中每隔6h取样，检测发酵过程中不同时间样品的OD

c)控制不同通气量的操作，5L发酵罐的通气量设置为：2L/min，3L/min，4L/min。5L发酵罐中的培养基灭菌后并降温至30℃时将二级种子液接种至发酵罐中培养基内，按照不同通气量进行培养，其余培养条件按照发酵罐初始培养条件培养至72h，发酵过程中每隔6h取样，检测发酵过程中不同时间样品的OD

进一步，发酵罐控制工艺条件为接种量，搅拌转速，通气量的优选为3％(v/v)，300rpm，4L/min。

进一步，对发酵罐控制工艺条件进行L9(3

本发明的有益效果在于

(1)在实验的过程中通过对溶藻菌培养基组成和培养条件及发酵工艺控制的调整和组和，使得向中肋骨条藻液中添加1％的发酵液后24h，其藻细胞数量减少率达到95％以上，与报道的常用培养方式相比，藻细胞数量减少率提高了2.88倍，控藻能力提升显著。

(2)本发明提供了一种提高微生物治理中肋骨条藻赤潮性能的方式，能够快速、规模化、可重复性的大量生产针对中肋骨条藻的溶藻菌液和溶藻活性物质。

(3)本发明方法有着操作简便，可重复性高且可以进一步放大培养等优点。

(4)本发明培养基成分简洁，材料易获取，培养条件可控，安全性高，培养时间短，培养成本低，能够推动溶藻菌在中肋骨赤潮治理中的应用。

附图说明

图1为提高海洋细菌对中肋骨条藻赤潮的溶藻效应的方法流程图。

图2为不同碳源对交替单胞菌FDHY-CJ的生长和溶藻率的影响图。

图3为不同氮源对交替单胞菌FDHY-CJ的生长和溶藻率的影响图。

图4为响应面优化两两交互显著因素3D图。

图5为控制接种量条件下交替单胞菌FDHY-CJ在发酵罐中的生长状态及溶藻率图。

图6为控制搅拌转速条件下交替单胞菌FDHY-CJ在发酵罐中的生长状态及溶藻率图。

图7为控制通气量条件下交替单胞菌FDHY-CJ在发酵罐中的生长状态及溶藻率图。

图8为交替单胞菌FDHY-CJ在发酵罐培养条件下的生长状态及溶藻率图。

图9为交替单胞菌FDHY-CJ在传统培养方式、优化培养基和发酵罐培养条件下的生物量和溶藻率对比图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例所涉及的交替单胞菌属(Alteromonas sp.)FDHY-CJ，其16S r RNA基因在Gen Bank的登录号为MN463606，该菌株已于文献【石新国,李悦,郑文煌,肖宇淳,刘乐冕,陈剑锋.一株中肋骨条藻特异溶藻菌的分离鉴定及溶藻特性[J].微生物学通报,2020,47(11):3527-3538.DOI:10.13344/j.microbiol.china.190991.】中公开，由福州大学生物科学与工程学院提供。

以下实施例中所涉及的2216E固体培养基，其配方为：5.0g/L蛋白胨，1.0g/L酵母提取粉，0.01g/L磷酸铁，30g/L海盐，15g/L琼脂粉；pH＝7.2；121℃灭菌20～25min。

以下实施例中所涉及的交替单胞菌FDHY-CJ一级种子液，其制备方法为：将冷冻保存的交替单胞菌FDHY-CJ接种于活化培养基中，于温度为25℃条件下培养24小时，得到活化菌种；将活化菌种单菌落接种于一级种子培养基中，于装液量为50ml/100ml、温度为25℃、转速为150rpm条件下培养24h，得到一级种子液。其中，所述活化培养基为2216E固体培养基，其配方为：5.0g/L蛋白胨，1.0g/L酵母提取粉，0.01g/L磷酸铁，30g/L海盐，15g/L琼脂粉；pH＝7.2；121℃灭菌20～25min。其中，所述一级种子培养基为2216E液体培养基，其配方为：5.0g/L蛋白胨，1.0g/L酵母提取粉，0.01g/L磷酸铁，30g/L海盐；pH＝7.2；121℃灭菌20～25min。

以下是示例所涉及的溶藻率的测定方法为：

将细菌培养物按2％(v/v)的比例加入到10ml对数期中肋骨条藻液中进行共培养24h，对照组加入等量的无菌培养基。共培养的培养基经卢戈氏碘液染色固定，在显微镜下观察其形态和数量。杀藻率的计算方法如下：

溶藻率＝(1-(C1÷C0))×100％          (1)

C1表示：实验组藻细胞数量；C0表示：对照组藻细胞数量

实施例1不同碳源对交替单胞菌FDHY-CJ生长和杀藻能力的影响

在2216E液体培养基的基础上添加终浓度0.5wt％的不同碳源(糖蜜、蔗糖、甘露醇、可溶性淀粉、半乳糖)，得到二级种子培养基。吸取2ml交替单胞菌FDHY-CJ一级种子液接种在含有不同碳源的二级种子培养基内，装液量为100ml/250ml，置于摇床内25℃，150rpm培养24h。培养结束后检测菌液的OD

实施例2不同氮源对交替单胞菌FDHY-CJ生长和杀藻能力的影响

在2216E液体培养基的基础上添加终浓度0.5wt％的不同氮源(蛋白胨、尿素、豆粉、硝酸钾、玉米浆干粉、酵母膏)，得到二级种子液。吸取2ml交替单胞菌FDHY-CJ一级种子液接种在含有不同氮源的培养基内，装液量为100ml/250ml，置于摇床内25℃，150rpm培养24h。培养结束后检测菌液的OD

实施例3用Plackett-Burman法筛选出显著因素

在发酵培养获得二级种子液的过程中，从碳源含量、氮源含量、pH、温度、接种量、装液量、摇床转速、发酵时间8个因素中筛选出能够显著影响交替单胞菌杀藻能力的因素。各因素水平设置如表1所示，使用软件Design Expert12设计出实验表2，根据表2实验结果如下表2所示，表3是对实验结果的方差分析，可以看出在8个因素中氮源含量、装液量和发酵时间3个因素对交替单胞菌FDHY-CJ的杀藻能力影响最显著。

表1不同因素及水平设置

表2 Plackett-Burman实验设计及结果

表3 Plackett-Burman实验结果方差分析

实施例4对显著影响溶藻菌杀藻能力的因素进行响应面分析

经过P-B设计，得到了三个最重要的影响因素(蛋白胨含量，装液量，发酵时间)。为了明确这三个因素之间的相互作用，确定最佳水平，在发酵培养获得二级种子液的过程中，采用中心组合设计，因素水平设置如表4所示，根据软件Design Expert12生成如表5的实验表。实验结果显示在表5中。经过二次多项式方差分析的实验结果(表6)得到下方程来描述细菌菌种的杀藻率与三个因素之间的关系。

溶藻率(％)＝0.75944+0.0293A-0.1599B-0.02369C+0.00815AB-0.00815AC-0.0163BC-0.02113A

模型的F值为21.75(P＜0.01)，说明模型的意义很大。失拟相的P值为0.8237，说明模型的失误模拟并不显著。表中的因子A、B、C、BC、A

表4显著因素的不同水平设置

表5响应面实验设计及结果

表6对响应面分析结果的方差分析

实施例5不同接种量发酵罐培养

将冷冻保存的交替单胞菌FDHY-CJ保藏菌种划线接种于活化培养基2216E固体平板培养基中，于25℃条件下在生化培养箱内培养24h，完成菌株活化培养。培养结束后接种环挑取1-2个单菌落接种于装有50ml一级种子培养基-2216E液体培养基的100ml锥形瓶内，在25℃的温度下以150rpm的转速培养24h，完成一级种子液的扩大培养，得到一级种子液。按照2％(v/v)的接种量将摇瓶培养的一级种子液接入装有灭菌后的二级种子液培养基中，其配方为：14.27g/L蛋白胨，5g/L可溶性淀粉，1.0g/L酵母提取粉，0.01g/L磷酸铁，30g/L海盐，pH＝7.2；在装液量为91.85ml/250ml，30℃的温度下以150rpm的转速培养23h，完成二级种子液的扩大培养。将二级种子液接入灭菌后的发酵罐的培养基中按照1％(v/v)，2％(v/v)，3％(v/v)的接种量进行发酵，发酵培养基与二级种子培养基相同。

发酵过程的培养温度30℃、通气量3L/min、搅拌转速150rpm、装液量3L/5L、罐压0.1Mpa，进行发酵培养。发酵过程中检测发酵液菌体生物量OD

实施例6不同转速发酵罐培养

如实施例5所述种子液培养方法获得二级种子液，将二级种子液接入灭菌后的发酵罐的培养基中按照100rpm，150rpm，300rpm的转速进行发酵，发酵培养基与二级种子培养基相同。

发酵过程的培养温度30℃、通气量3L/min、接种量为3％、装液量为3L/5L、罐压为0.1MPa，进行发酵培养。发酵过程中检测发酵液菌体生物量OD

实施例7不同通气量发酵罐培养

如实施例5所述种子液培养方法获得二级种子液。将二级种子液接入灭菌后的发酵罐培养的培养基中按照2L/min，3L/min，4L/min的通气量进行发酵，发酵培养基与二级种子培养基相同。

发酵过程的培养温度30℃、转速150rpm、接种量为3％、装液量为3L/5L、罐压为0.1MPa，进行发酵培养。发酵过程中检测发酵液菌体生物量OD

实施例8发酵罐控制工艺正交实验

如实施例5所述种子液培养方法获得二级种子液。将二级种子液接入灭菌后的发酵罐培养的培养基中按照正交表所列控制工艺进行发酵其余发酵参数为温度30℃、装液量为3L/5L、罐压为0.1MPa，发酵培养基与二级种子培养基相同。结果如表4所示，最佳组合为A2C3B2，即3％接种量、300rpm和6L/min通气量。

表7L9(33)正交实验表设计及结果

实施例95L发酵罐培养

如实施例5所述种子液培养方法获得二级种子液。将二级种子液接入灭菌后的发酵罐培养的培养基中进行培养，发酵培养基与二级种子培养基相同。发酵过程的培养温度30℃、转速300rpm、接种量为3％、通气量为6L/min、装液量为3L/5L、罐压为0.1MPa进行发酵培养。发酵过程中检测发酵液菌体生物量OD

综合以上实施例，最终确定一种提高海洋细菌对中肋骨条藻赤潮的溶藻效应的方法，其包括以下步骤：

步骤一、菌种活化

将冷冻保存的交替单胞菌FDHY-CJ接种于活化培养基中，于温度为25℃条件下培养24小时，得到活化菌种；其中，所述活化培养基配方为：5.0g/L蛋白胨，1.0g/L酵母提取粉，0.01g/L磷酸铁，30g/L海盐，15g/L琼脂粉；pH＝7.2；

步骤二、种子培养

将活化菌种单菌落接种于一级种子培养基中，于装液量为50ml/100ml、温度为25℃、转速为150rpm条件下培养24h，得到一级种子液；将一级种子液以2％(v/v)的接种量接种于二级种子培养基中，于装液量为91.85ml/250ml、温度为30℃、转速为150rpm条件下培养23h，得到二级种子液；其中，所述一级种子培养基配方为：5.0g/L蛋白胨，1.0g/L酵母提取粉，0.01g/L磷酸铁，30g/L海盐；pH＝7.2；所述二级种子培养基配方为：14.27g/L蛋白胨，5g/L可溶性淀粉，1.0g/L酵母提取粉，0.01g/L磷酸铁，30g/L海盐；pH＝7.2；

步骤三、发酵培养

将二级种子液以3％(v/v)的接种量接种于发酵罐内的发酵培养基中，在装液量为3L/5L、罐压为0.1MPa、通气量为6L/min、温度为30℃、转速为300rpm条件下发酵培养12-18h；其中，所述发酵培养基与二级种子培养基相同。

图9显示了交替单胞菌FDHY-CJ分别在2216E培养基(对应于一级种子液)、优化培养基(对应于二级种子液)、发酵罐培养条件下其生物量和对中肋骨条藻的抑制作用效果。结果表明在2216E培养基组内，交替单胞菌FDHY-CJ的生物量达到1.62，在2％(v/v)菌藻比条件下24h溶藻率达到42％；在优化培养基组内，交替单胞菌FDHY-CJ的生物量达到6.24，在2％(v/v)菌藻比条件下24h溶藻率达到80％；在发酵罐培养组内，交替单胞菌FDHY-CJ的生物量达到10.65，在1％(v/v)菌藻比条件下24h溶藻率达到95％以上。