一种治疗膝骨关节炎的中药组合物及其制备方法和应用

摘要

本发明提供一种治疗膝骨关节炎的中药组合物，所述中药组合物由以下重量份数的各原料药制备而成：川牛膝15‑25份、熟地黄15‑25份、锁阳15‑25份、千年健15‑25份、雪莲花15‑25份、狗脊15‑25份、葫芦巴15‑25份、乌梢蛇15‑25份、徐长卿10‑20份、油松节10‑20份、延胡索10‑20份、乌药10‑20份、当归15‑25份、川芎10‑20份、山药15‑25份、茯苓15‑25份、青皮10‑20份、泽泻15‑25份、甘草10‑20份。本发明的中药组合物能够有效治疗膝骨关节炎。

说明书

技术领域

本发明涉及一种治疗膝骨关节炎的中药组合物及其制备方法和应用。

背景技术

膝骨关节炎(KOA)是以关节软骨退行性病变和继发性骨质增生为特征的慢性关节疾病，以膝关节疼痛、肿胀、活动受限甚至关节畸形为主要症状，常见于中老年人。流行病学调查显示，55岁以上人群患病率为44％～70％，65岁以上人群中男性患病率约60％，女性则高达70％。目前膝骨关节炎的治疗方法很多，西药多使用非甾体抗炎药，长期使用副作用诸多；外科手术存在一定局限性和风险，远期疗效差。中医学认为膝骨关节炎属中医痹证、骨痹范畴，病名最早出自孙思邈的《备急千金要方》，病因为受风寒湿热之邪，闭阻经络，气血不畅等引起患处关节疼痛、酸楚、肿胀、重着及活动不利。病机以肝肾亏虚为本，外邪侵袭、经络闭阻、不通则痛、气血失常为标。且与体质因素、气候条件、生活环境等密切相关。

中药制剂为任何药物供临床使用之前都必须制成适合于医疗或预防应用的形式。病情有缓有急，病症有表有里，因此对于剂型的要求也有不同。为了更好发挥药物的疗效，根据药物的性质，也对剂型和制剂的要求有所不同。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种治疗膝骨关节炎的中药组合物及其制备方法。本申请的中药组合物治疗早中期膝骨关节炎疗效显著，副作用小，疗效稳定，能够显著改善膝骨关节炎疼痛、功能障碍，提高患日常生活质量。本申请的中药组合物在临床应用主要以配方颗粒剂型为主，它克服了传统中药煎煮时间长、不易保存、携带不便等诸多的不足，而且在一定程度上保证了中医辨证施治的特色，使中药治疗效果得到充分发挥。本申请的中药组合物颗粒剂将传统中药饮片的药物成分通过现代化技术进行提取、分离，制成中药制剂，避免了较长的煎煮时间，也可有效防止中药饮片保管不当导致的发霉、虫蛀等问题。

本发明提供一种治疗膝骨关节炎的中药组合物，所述中药组合物由以下重量份数的各原料药制备而成：川牛膝15-25份、熟地黄15-25份、锁阳15-25份、千年健15-25份、雪莲花15-25份、狗脊15-25份、葫芦巴15-25份、乌梢蛇15-25份、徐长卿10-20份、油松节10-20份、延胡索10-20份、乌药10-20份、当归15-25份、川芎10-20份、山药15-25份、茯苓15-25份、青皮10-20份、泽泻15-25份、甘草10-20份。

作为优选，所述中药组合物由以下重量份数的各原料药制备而成：川牛膝15份、熟地黄15份、锁阳15份、千年健15份、雪莲花15份、狗脊15份、葫芦巴15份、乌梢蛇15份、徐长卿10份、油松节10份、延胡索10份、乌药10份、当归15份、川芎10份、山药15份、茯苓15份、青皮10份、泽泻15份、甘草10份。

本发明还提供上述中药组合物的制备方法，将配方量的各原料药混合后用水浸泡，以渗透药物组织为度，然后加入过药30-35mm的水煎煮40-45分钟，过滤取药液后，在滤渣中再加入过药25-30mm的水煎煮30-35分钟，过滤并合并滤液。

本发明还提供上述中药组合物的制备方法，将配方量的各原料药混合后粉碎成细粉，过120目筛，使能通过筛的细粉量达到50％，收集过筛细粉；再将粗粉用水提取两次，合并滤液，将滤液加热浓缩干燥并研磨成细粉，将两种细粉混合后装入胶囊壳体内，得到胶囊剂。

本发明还提供上述中药组合物的制备方法，将配方量的各原料药混合后加8-10倍重量水浸泡0.5h，煎煮2次，第1次煎煮1.5h，第2次加8-10倍重量水煎煮1h，合并煎液，过滤，浓缩得浸膏，干燥并粉碎成细粉，加入辅料制粒，得到颗粒剂。

本发明还提供上述的中药组合物在制备治疗膝骨关节炎的药物中的应用。

本发明还提供一种药物，其有效成分包括上述的中药组合物。

作为优选，所述药物还包括辅料；所述辅料为药学上常用的辅料。

作为优选，所述药物包括水煎剂、胶囊剂和颗粒剂。

本申请发明人依据对甘肃地区膝骨关节炎体质进行流行病学发现，主要以阳虚体质为主，在此基础上，结合治疗膝骨关节炎的经验，总结出本申请的中药制剂，提出肝肾亏虚、筋脉失养是根本原因，风寒湿痹是外在因素的思想，证属肝肾亏虚，病机为“本虚标实、虚实夹杂”之证。关节失养，活动不能，不荣则痛；风寒侵袭，筋脉阻滞，不通则痛。治疗以补益肝肾，散寒除湿，通痹止痛。本申请的中药制剂是团队多年临床实践总结的经验方，全方由川牛膝、熟地黄、锁阳、千年健、雪莲花、狗脊、葫芦巴、乌梢蛇、徐长卿、油松节、延胡索、乌药、当归、川芎、山药、茯苓、青皮、泽泻、甘草，共19味中药组成，配伍得当、标本兼治，诸药合用，共奏补肝益肾，散寒祛风，通痹止痛之功。

方解：方中以熟地黄、川牛膝、千年健、锁阳以填精补髓、补益肝肾、柔和经脉、强壮筋骨为君药；雪莲花、狗脊、葫芦巴助君药补益肝肾、温阳宣痹，乌梢蛇、徐长卿、油松节散寒除湿，通痹止痛，逐邪外出，延胡索、乌药活血行气，温经止痛，以上共为臣药；当归、川芎养血活血、通络止痛，山药、茯苓、青皮健脾行气除湿，制约熟地黄、川牛膝、锁阳等滋腻之嫌，佐助药物功效的发挥，泽泻水利渗湿消肿，佐制其他药物过于温燥；甘草缓急止痛、调和诸药为使药。全方配伍得当、严谨精炼、标本兼治。诸药为伍，补肝肾，散寒湿，通痹止痛。

本申请发明人对本申请的中药制剂进行现代网络药理学研究，发现其中的槲皮素、山柰酚及β-谷甾醇是核心活性成分。槲皮素是一种广泛存在于中药材中的黄酮类化合物，其具有抗肿瘤、氧化，抑制炎症、病毒和调节免疫反应。现代药理研究表明槲皮素能够诱导RAW264.7细胞释放能够显著抑制一氧化氮、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-6和IL-1β的分泌，是治疗KOA潜在的抗炎镇痛药物。山柰酚与槲皮素有着相似的作用，具有抗氧化、抗炎、调节免疫和类雌激素作用的药理活性，对OA、RA及骨质疏松症等有防治作用。β-谷甾醇同样具有降胆固醇、抗氧化、抗炎、抑菌和类激素功能等多种生物活性。综上所述，本申请的中药制剂在治疗KOA具有抗炎镇痛、调节免疫的作用。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为各组大鼠不同阶段右后膝关节直径变化分析图(n＝10)。

图2为各组大鼠膝关节大体观察图。

图3为大鼠膝关节大体观察评分。

图4为各组大鼠右下肢膝关节软骨HE染色(×100)。

图5为改良Mankin评分。

图6为各组大鼠软骨组织中IL-1β、TNF-αmRNA的表达情况。

图7为各组关节软骨中Aggrecan、CollagenⅡ、TIMP1、MMP13蛋白表达情况。

图8为各组大鼠软骨组织中Aggrecan、CollagenⅡ、TIMP1、MMP13 mRNA的表达情况。

图9为各组关节软骨中自噬相关蛋白表达情况。

图10为各组大鼠软骨组织中LC3、P62 mRNA表达情况。

图11为各组关节软骨中P-AMPK、P-mTOR、P-ULK1表达情况。

图12为各组大鼠软骨组织中AMPK、mTOR、ULK1 mRNA表达情况。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

在本发明中，“通痹健骨方”是指本发明的中药组合物。

本发明的一种治疗膝骨关节炎的中药组合物由以下重量份数的原料药组成：

川牛膝15-25份、熟地黄15-25份、锁阳15-25份、千年健15-25份、雪莲花15-25份、狗脊15-25份、葫芦巴15-25份、乌梢蛇15-25份、徐长卿10-20份、油松节10-20份、延胡索10-20份、乌药10-20份、当归15-25份、川芎10-20份、山药15-25份、茯苓15-25份、青皮10-20份、泽泻15-25份、甘草10-20份。

本发明的用于治疗膝骨关节炎的中药组合物水煎剂的制备方法如下：

按照上述重量份称取所有原料药材放入纯净水中浸泡，以渗透药物组织为度，一般浸泡时间为半小时，继而再将浸泡好的药物和浸泡药物的澄清液一并放入煎药机内，注入过药30-35mm的纯净水进行第一次煎煮40-45分钟，滤取药液后，再次注入过药25-30mm的纯净水进行第二次煎煮30-35分钟，混合得水煎剂。

本发明的中药组合物水煎剂的使用方法：口服，每日一剂，二次分服。

本发明的用于治疗膝骨关节炎的中药组合物胶囊剂的制备方法如下：

按照上述重量份称取所有原料药材，混合后粉碎成粗粉，再次粉碎，过120目筛，使能通过筛的细粉量达到50％，收集能够通过筛的细粉；再将不能通过的粗粉投入多功能中药提取罐提取2次，第一次加8倍重量水煎煮2小时，第二次加3-5倍重量水煎煮1小时，过滤并合并两次煎液，加热浓缩至糊状，放入烘箱70℃烘干后静置到室温，研磨成细粉，将两种细粉混合后装入胶囊壳体中，即得胶囊剂。

受到粉碎技术的限制，若将所有的中药都进行粉碎，部分粗粉不能粉碎成细粉过100目-120目筛，故采用多功能中药提取罐用水提取以辅助粉碎成细粉，同时不会对中药药性进行破坏。

本发明的中药组合物胶囊剂的使用方法：口服，每日2次，一次4-6粒。

本发明的用于治疗膝骨关节炎的中药组合物颗粒剂的制备方法如下：

按照上述重量份称取所有原料药材，混合后加8-10倍重量水浸泡0.5h，煎煮2次，第1次煎煮1.5h，第2次加8-10倍重量水煎煮1h，合并煎液，过滤，滤液依次常压浓缩(100℃)和减压浓缩(-70℃，-0.1MPa)至相对密度为1.25(70℃)的浸膏，干燥，粉碎成细粉，再加入蔗糖(干膏粉：蔗糖的重量比＝1：2)，搅拌10min，混匀，以85％乙醇(干膏粉：85％乙醇的重量比＝1：0.40)制粒，干燥，整粒，分装，即得。

本发明的中药组合物颗粒剂的使用方法：将颗粒剂放入容器中，加入沸水浸泡4min，搅拌均匀后口服，每日1剂，每日2次。

实施例1

本发明的用于治疗膝骨关节炎的中药组合物的配方如下：

川牛膝15g、熟地黄15g、锁阳15g、千年健15g、雪莲花15g、狗脊15g、葫芦巴15g、乌梢蛇15g、徐长卿10g、油松节10g、延胡索10g、乌药10g、当归15g、川芎10g、山药15g、茯苓15g、青皮10g、泽泻15g、甘草10g。

本发明的用于治疗膝骨关节炎的中药组合物的水煎剂的制备方法为：

按照上述质量份比选购优质干净的各原料药材，分别除去杂质和粉尘后，将诸药放入冷开水中浸泡半小时，渗透药物组织为度，继而再将浸泡好的药物和浸泡药物的澄清液一并放入煎药机内，注入过药35mm的冷开水进行第一次煎煮40分钟，滤取药液后，再次注入过药30mm的纯净水进行第二次煎煮35分钟，混合浓缩成50％的中药液400毫升后，入冰箱保鲜备用。

本实施例的中药组合物水煎剂的使用方法：口服，每日一剂，二次分服。

实施例2

本发明的用于治疗膝骨关节炎的中药组合物的配方与实施例1相同。

本发明的用于治疗膝骨关节炎的中药组合物的胶囊剂的制备方法为：

按照重量份数比称取所有原料药材，粉碎成粗粉，再进一步粉碎，过120目筛，使能通过筛的细粉量达到50％，收集通过筛的细粉；再将不能通过的粗粉投入多功能中药提取罐提取2次，第一次加10倍重量水煎煮2小时，第二次加5倍重量水煎煮1小时，过滤并合并两次煎液，加热浓缩至糊状，放入烘箱70℃烘干后静置到室温，研磨成细粉，将两种细粉混合后装入胶囊壳体中，即得胶囊剂。

实施例3

本发明的用于治疗膝骨关节炎的中药组合物的配方与实施例1相同。

本实施例的中药组合物的中药颗粒剂的制备方法如下：

按照上述重量称取所有原料药材，混合后加8倍重量水浸泡0.5h后，煎煮2次，第1次煎煮1.5h，第2次加8倍重量水煎煮1h，合并煎液，过滤，滤液依次常压浓缩(100℃)和减压浓缩(70℃，-0.1MPa)至相对密度为1.25(70℃)的浸膏，干燥，粉碎成细粉，再加入蔗糖(干膏粉：蔗糖的重量比＝1：2)，搅拌10min，混匀，以85％乙醇(干膏粉：85％乙醇的重量比＝1：0.40)制粒，干燥，整粒，分装，即得。

本发明的中药组合物颗粒剂的使用方法如下：

上述制备所得颗粒剂为1剂用量，分早晚两次服用。

将颗粒剂放入容器中，加入沸水300mL，浸泡4min，搅拌均匀后口服。

治疗周期为2个疗程，每一疗程7天。

实施例4

本发明的用于治疗膝骨关节炎的中药组合物的配方如下：

川牛膝25g、熟地黄25g、锁阳25g、千年健25g、雪莲花25g、狗脊25g、葫芦巴25g、乌梢蛇25g、徐长卿20g、油松节20g、延胡索20g、乌药20g、当归25g、川芎20g、山药25g、茯苓25g、青皮20g、泽泻25g、甘草20g。

本发明的用于治疗膝骨关节炎的中药组合物的水煎剂的制备方法为：

按照上述质量份比选购优质干净的各原料药材，分别除去杂质和粉尘后，将诸药放入冷开水中浸泡半小时，渗透药物组织为度，继而再将浸泡好的药物和浸泡药物的澄清液一并放入煎药机内，注入过药30mm的冷开水进行第一次煎煮45分钟，滤取药液后，再次注入过药25mm的纯净水进行第二次煎煮30分钟，混合浓缩成50％的中药液400毫升后，入冰箱保鲜备用。

实施例5

本发明的用于治疗膝骨关节炎的中药组合物的配方如下：

川牛膝20g、熟地黄20g、锁阳20g、千年健20g、雪莲花20g、狗脊20g、葫芦巴20g、乌梢蛇20g、徐长卿15g、油松节15g、延胡索15g、乌药15g、当归20g、川芎15g、山药20g、茯苓20g、青皮15g、泽泻20g、甘草15g。

本发明的中药组合物的中药颗粒剂的制备方法如下：

按照上述重量称取所有原料药材，混合后加10倍重量水浸泡0.5h后，煎煮2次，第1次煎煮1.5h，第2次加9倍重量水煎煮1h，合并煎液，过滤，滤液依次常压浓缩(100℃)和减压浓缩(70℃，-0.1MPa)至相对密度为1.25(70℃)的浸膏，干燥，粉碎成细粉，再加入蔗糖(干膏粉：蔗糖的重量比＝1：2)，搅拌10min，混匀，以85％乙醇(干膏粉：85％乙醇的重量比＝1：0.40)制粒，干燥，整粒，分装，即得。

实施例6基于网络药理学和分子对接技术探析本发明的中药组合物治疗膝骨关节炎的作用机制

1本发明的中药组合物的活性成分及靶点的筛选

本申请发明人经现代网络药理学研究发现，本发明的中药组合物的核心活性成分为槲皮素、山柰酚及β-谷甾醇。具体见表1。

表1本发明的中药组合物主要活性成分基本信息

2分子对接验证

选取度值较高的关键靶点IL-1β，MMP-3及TNF-α作为受体，以本发明的中药组合物的核心活性成分作为配体，进行分子对接验证。具体见表2。

表2本发明的中药组合物核心活性成分与关键靶点分子对接分数

3本发明的中药组合物对KOA软骨细胞上清液中IL-1β，MMP-3，TNF-α表达的影响

实验设4组，分别为空白对照组、本发明的中药组合物低浓度组、中浓度组和高浓度组。将本发明实施例1制备的的中药组合物水煎剂离心10min(转速2000r·min

实验过程与实施例8相同。

与空白对照组比较，本发明的中药组合物各浓度组上清液中IL-1β，MMP-3及TNF-α水平均降低(P<0.05)；高浓度组与中、低浓度组比较，高浓度组较低且IL-1β，MMP-3及TNF-α水平下降程度与本发明的中药组合物浓度呈剂量依赖性，结果见表3。

表3本发明的中药组合物对KOA软骨细胞上清液中IL-1β，MMP-3，TNF-α表达的影响

注：与空白组比较

4本发明的中药组合物对KOA软骨细胞NF-κB p65 mRNA，IκB-αmRNA表达的影响

实验分组与步骤3相同。

实验过程与实施例8相同。

与空白组比较，本发明的中药组合物各组NF-κB p65 mRNA水平均降低(P<0.05)，IκB-αmRNA水平均升高(P<0.05)；高浓度组与中、低浓度组比较，高浓度组NF-κB p65mRNA较低，IκB-αm RNA水平较高，且NF-κB p65 mRNA水平下降程度，IκB-αmRNA水平升高程度与本发明的中药组合物浓度呈剂量依赖性，结果见表4。

表4本发明的中药组合物对KOA软骨细胞NF-κB p65，IκB-αm RNA表达的影响

本发明的中药组合物主要作用机制在于应用槲皮素，山柰酚，β-谷甾醇等活性成分，以IL-1β，MMP-3及TNF-α为关键靶点，通过NF-κB信号通路发挥治疗膝骨关节炎的作用。

实施例7本发明的中药组合物治疗早中期KOA的临床疗效

1膝骨关节炎KOA临床测试研究对象

1.1病例来源

收集2020年11月至2022年1月在甘肃省中医院骨科门诊、住院部就诊符合诊断标准的早中期KOA患者56例。

1.2制定病例报告表

病例报告表组成包括：受试者知情同意书、一般资料、VAS评分、WOMAC评分、计时起-立行走测试、6分钟行走测试、关节主被动活动度，安全性评估检测。一般资料包括患者性别、年龄、身高、体重、现病史、既往史、过敏史等。受试者知情同意书，本项目通过伦理委员会伦理审核，所有受试者需签署知情同意书。

1.3纳入标准

(1)符合中医和西医KOA诊断标准；

(2)符合《膝骨关节炎中医诊疗指南(2020年版)》证候诊断标准；

(3)符合Kellgren-Lawrence(K-L)的放射学诊断分级为Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ级患者；Ⅰ或Ⅱ级为早期，Ⅲ级为中期。

(4)符合中医临床分期标准；

(5)年龄50～70岁；

(6)近1月内未经膝骨性关节炎系统治疗患者，且能按计划坚持完成治疗，并能够配合临床观察者及随访；

(7)受试者在完全了解本研究的性质，本人疾病的性质，能理解并签署知情同意书。

2 研究方法

2.1 临床试验设计方法

本次试验采取临床研究常用的简单随机方法进行分组，按照患者就诊次序进行随机分组，第1个符合纳入标准的患者入A组，第2个符合纳入标准的患者入B组，以此类推，共收集符合纳入标准的患者56例，本发明实施例1制备的的中药组合物治疗组(A组)28例，双氯芬酸钠缓释胶囊(对照组B组)28例。

2.2治疗方案

两组均采用以健康宣教为主的基础治疗。在每组给予基础治疗的情况下，A组介入本发明实施例1制备的的中药组合物；B组双氯芬酸钠缓释胶囊，两组均进行每周7次的治疗，一个疗程为7天，治疗周期为2个疗程。

2.2.1基础治疗

基础治疗主要以健康宣教为主，具体内容如下：

(1)告知患者KOA发病诱因；

(2)KOA日常生活预防；

(3)KOA膝关节股四头肌伸缩锻炼。

2.2.2本发明的中药组合物组治疗方案：

治疗方法见实施例1，一周为一个疗程，治疗周期为2个疗程。

2.2.3对照组治疗方案：

给予双氯芬酸钠缓释胶囊(欣泰青)，生产企业：润海润都制药股份有限公司。服用方法：口服，2粒(100mg)/1次，1次/日，饭后30min温水冲服。

2.3疗效观察指标

2.3.1病例一般资料：

包括患者的基本资料，其中包括患者的性别、年龄、病程和影像学Kellgren-Lawrence分级。

2.3.2观察指标：

2.3.2.1VAS评分：

采用脸谱疼痛评分表，无痛/剧痛之间划一条长线，线上标注1-10刻度，配上从笑脸到苦脸脸谱，线上不作特殊标记或词语，以免影响评估结果。笑脸端代表无痛，苦脸(大哭)端代表剧痛，让患者选择出最能描绘自己疼痛程度的脸谱或者数字。0分：无痛；3分以下：有轻微的疼痛；4分-6分：患者疼痛并影响睡眠，尚能忍受；7分-10分：患者有渐强烈的疼痛，疼痛难忍，影响食欲，影响睡眠。

2.3.2.2WOMAC骨关节炎指数评分：

问卷分为三个模块：①疼痛：包含5个问题；疼痛度越高，分值越高；②僵硬程度，包括2个问题；僵硬程度越高，分值越高；③日常活动感觉困难程度，包含17个问题；困难程度越高，分值越高。总分≥40分为1级，20-39分为2级，10-19分为3级，0-9分为4级。总分值越低，等级越高，KOA对患者的日常生活影响程度越小。

2.3.2.3计时起立行走测试：

一种快速定量评定功能性步行能力的方法。评定时患者着平底鞋，坐在有扶手的靠背椅上(椅子座高约45cm，扶手高约20cm)，身体靠在椅背上，双手放在扶手上。如果使用助行具(如手杖、助行架)，则将助行具握在手中。在离座椅3米远的地面上贴一条彩条或划一条可见的粗线或放一个明显的标记物。当测试者发出“开始”的指令后，患者从靠背椅上站起。站稳后，按照平时走路的步态，向前走3米，过粗线或标记物处后转身，然后走回到椅子前，再转身坐下，靠到椅背上。测试过程中不能给予任何躯体的帮助。测试者记录患者背部离开椅背到再次坐下(靠到椅背)所用的时间(以秒为单位)以及在完成测试过程中出现可能会摔倒的危险性。10秒以内的时间表示活动正常。11～20秒是体弱的老年人和残疾人的正常范團，超过20秒的时间表示需要帮助，表示需要进一步检查和千预。

2.3.2.4 6分钟行走测试，测试受试者6分钟内走的距离，单位为米。

2.3.2.5关节主被动活动度：测量患膝的主被动活动度(以色列KAPRO开普路992电子数显尺量角器)。

2.4疗效评定标准

按照《中药新药临床研究指导原则》(2002版)中对疾病疗效判定标准，根据受试者在经过治疗后症状减轻、体征改善程度的不同表现，将临床疗效分为临床控制、显效、有效、无效四级，具体如下：

①临床控制：疼痛消失，关节活动恢复正常，积分减少≥95％；

②显效：疼痛消失，关节活动范围不受限，关节负重活动及耐久力稍欠缺，积分减少≥70％，<95％；

③有效：疼痛基本消失，关节活动范围轻度受限，积分减少≥30％，<70％；

④无效：疼痛与关节活动无明显改善，积分减少不足30％。

注：计算公式(尼莫地平法)：有效率＝[(治疗前WOMAC积分-治疗后WOMAC积分)÷治疗前WOMAC积分]×100％。

2.5安全性评估

安全性观察指标：

(1)血、尿常规，肝功能、肾功能，心电图。于治疗前、治疗2周后分别观察一次。

(2)不良反应：药物组观察研究期间是否胃肠道反应，主要为胃不适、腹痛、烧灼感、反酸、纳差、便秘、恶心等；发现不良反应时，应根据情况决定是否予以干预措施，并判定该不良反应是否与本试验治疗有关系，依据病情判定是否中止试验。如实的记录研究期间不良反应发生的程度、时刻及持续时间、采取的处理及转归如何。

2.6统计学处理

统一运用版本SPSS26.0的统计学软件对数据进行统计分析，本次所有数据分析结果在表中统一以“均数±标准差

3本发明的中药组合物治疗早中期KOA的临床疗效

试验采取简单随机方法，共收集符合纳入标准的患者56例：本发明实施例1制备的中药组合物治疗组(A组)28例，双氯芬酸钠缓释胶囊(对照组B组)28例。两组均采用以健康宣教为主的基础治疗。在每组给予基础治疗的情况下，A组介入本发明实施例1制备的中药组合物治疗组；B组介入双氯芬酸钠缓释胶囊，两组均进行每周7次的治疗，一个疗程为7天，治疗周期为2个疗程。

3.1治疗前后VAS评分比较

VAS评分各组治疗前后组内比较有统计学意义(p＜0.01)，组间两两比较，A组与B组比较无统计学意义(p＞0.05)。说明两组治疗早中期KOA疼痛均有效果。具体见表5。

表5两组治疗前后VAS评分比较

注：与本组治疗前比较，

3.2治疗前后WOMAC评分比较

WOMAC总评分各组治疗前后组内比较有统计学意义(p＜0.01)。A组与B组比较无统计学意义。具体见表6。

表6两组患者治疗前后WOMAC评分总分比较

注：与本组治疗前比较，

3.3治疗前后计时起-立行走测试比较

功能性步行能力评估各组治疗前后组内比较有统计学意义(p＜0.01)。A组与B组比较无统计学意义(p＞0.05)。说明两组改善早中期KOA患者功能性步行能力均有效果。具体见表7。

表7两组患者治疗前后计时起-立行走测试时间(s)比较

注：与本组治疗前比较，

3.4治疗前后6分钟行走测试比较

6分钟行走测试各组治疗前后组内比较有统计学意义(p＜0.01)。A组与B组比较无统计学意义(p>0.05)。说明两组提高早中期KOA患者行走能力均有效果。具体见表8。

表8两组患者治疗前后6分钟行走测试距离(m)比较

注：与本组治疗前比较，

3.5治疗前后膝关节主被动屈曲活动度比较

膝关节主被动屈曲活动度各组治疗前后组内比较有统计学意义(p＜0.01)。A组与B组比较无统计学意义(p>0.05)。具体见表9。

表9两组患者治疗前后膝关节主动屈曲活动度比较

注：与本组治疗前比较，

3.6治疗前后膝关节主被动伸直活动度比较

膝关节主被动伸直活动度各组治疗前后组内比较有统计学意义(p＜0.05)。A组与B组比较无统计学意义(p>0.05)。具体见表10。

表10两组患者治疗前后膝关节主被动伸直活动度比较

注：与本组治疗前比较，

3.7临床有效率

两组治疗后各组有效率比较，A组75.0％，B组89.2％，见表11。

表11两组临床有效率比较

3.8安全性评估

两组共56例患者，研究期间，A组出现3例出现了轻度胃痛、消化不良等胃肠道反应；2例出现便秘；B组出现8例胃不适、腹痛、反酸、纳差、便秘，未出现溃疡、出血、穿孔。其余患者血、尿、粪常规，肝、肾功，治疗前、后检查均正常，具体见表12。

表12各组不良反应发生率

实施例8本发明的中药组合物对KOA大鼠模型的治疗作用及对自噬的影响

将50只SD大鼠随机分为对照组、模型组、本发明实施例1制备的中药组合物(以下简称“通痹健骨方”)低、中、高剂量组，每组10只，除对照组外，其余组采用改良Hulth法建立KOA模型，给予相应药物灌胃4w后麻醉取材；治疗期间观察大鼠一般情况及测量膝关节直径变化，取材时大体观察各组关节变化，HE染色及改良Mankin评分评价关节软骨退变情况；WB法检测各组软骨MMP-13、TIMP1、Aggrecan、Collagen II、LC3、P62、P-ULK1、P-AMPK、P-mTOR表达；qRT-PCR法检测MMP-13、TIMP1、Aggrecan、CollagenII、LC3、P62、ULK1、AMPK、mTOR、IL-1β、TNF-αmRNA表达。

1 实验材料

1.1 实验动物

50只SPF级SD大鼠(雌雄各半)，体重(160g±20g)，8周龄；购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，动物质量合格证号：SCXK(京)2019-0010(见附录1)。动物饲养、造模、干预均在甘肃中医药大学SPF级动物实验中心SYXK(甘)2020-0009(]见附录2)。动物造模、干预、取材等操作符合科技部《关于善待实验动物的指导性意见》(2006年修订)的规定，实验全程严格遵循甘肃中医药大学动物实验伦理学规定(伦理号：2021-1 85)，见附录3。

1.2实验药物

通痹健骨方中所有药材均购自甘肃省中医院药剂科，符合2020年版《中华人民共和国药典》要求。

2 实验方法

2.1 分组与造模

50只SD大鼠适应性喂养1周后，随机分为对照组和模型组、通痹健骨方低剂量组、通痹健骨方中剂量组、通痹健骨方高剂量组，每组10只，除对照组10只不做任何处理外，其余40只SD大鼠采用改良Hulth法建立KOA大鼠模型。大鼠麻醉采用7％水合氯醛5ml/kg腹腔注射，待完全麻醉后，备皮、消毒、铺巾，取右后膝髌骨内侧切口切开皮肤、关节囊，切断内侧副韧带和前交叉韧带，完全切除内侧半月板，注意勿损伤关节软骨面。用一次性10mL注射器吸取生理盐水冲洗关节腔3次，行抽屉试验检查阳性后，彻底止血，逐层缝合关节囊及皮肤切口，术后伤口涂抹红霉素软膏，并且连续3d肌肉注射青霉素20万单位/d，防止感染，造模后1周将所有造模动物驱赶30min/d，各组大鼠均在相同条件下，自由饮水，摄食，造模4周后，进行后续实验。

2.2药物制备

通痹健骨方水煎剂按照本发明实施例1方法制备。

2.3药物干预

造模4周后，根据“人与大鼠的体表面积换算法”鼠用药剂量(g·kg/d)＝人用剂量(g/d)/60kg×0.018×5，通痹健骨方低、中、高剂量组分别为2、4、8mL/kg/d，对照组及模型组给予等量生理盐水灌胃，灌胃前将配制好合适浓度的通痹健骨方药液加热至合适温度。灌胃过程中宜动作轻柔缓慢，尽量减少对大鼠不必要的伤害。灌胃后将大鼠放回笼中观察。连续治疗4周后进行相关指标检测。

2.4一般情况观察及测量大鼠膝关节直径

观察各组大鼠的饮食，饮水，活动度，灵敏度，精神状态，膝关节的畸形、肿胀、活动情况，下肢肢端血运及肌肉丰满程度；各组于造模前后、治疗4周后测量右侧膝关节直径，测量方法：用游标卡尺测量膝关节直径，重复三次，计算平均值。

2.5取材

大鼠麻醉后，分离膝关节周围肌肉、韧带及滑膜后，取下大鼠右后膝关节内侧关节软骨组织，一部分标记各组标本后置于4％甲醛中固定，用于HE染色等相关实验使用；另外一部分标记各组标本后置于-80℃冰箱中保存，后续进行qRT-PCR、Western blot等实验。

2.6大鼠膝关节大体观察

取材时将各组大鼠造模侧膝关节分离干净后，暴露关节腔，对关节软骨进行大体观察并评分。评分与膝关节软骨退变呈正比，分数越高，代表关节软骨退变越严重，评分细节详见表13。

表13膝关节软骨大体观察评分表

2.7膝关节软骨组织HE染色

①脱钙取出固定在4％甲醛中的标本，用自来水冲洗4-6h后，浸入醋酸进行脱钙1月。

②脱水及透明将软骨组织放入不同浓度梯度酒精中脱水，浓度越高，时间越短；软骨组织经酒精脱水后，须经过透明，用透明剂二甲苯替换出脱水剂，进行石蜡包埋，具体步骤见表14。

表14软骨组织脱水步骤

③浸蜡透明后的软骨组织依次经3缸石蜡(60℃)进行浸蜡，实验全程均在生物组织脱水机里完成，详见表15。

表15软骨组织浸蜡实验步骤

④包埋将浸透蜡的软骨组织块包裹在石蜡块中。包埋用蜡的温度应略高于浸蜡温度，保证组织块与包埋石蜡完全融为一体。

⑤切片和烤片切片前先将蜡块切面在冻台上冷冻几分钟，然后将所要切的包埋块固定在标本夹上，在微动装置上调节切片要求的厚度(4μm)，将刀台移至近标本台处，进行切片。

切好的切片必须贴附于载玻片上才能作进一步处理，但是切片常有细小的横纹，必须经展平后才能贴附，否则影响染色和观察。捞片，首先将连串的切片放入到42℃左右的温水浴展片锅中，用镊子将切片分开，然后用APES或多聚赖氨酸处理过的防脱玻片倾斜着插入水面去捞取切片，使切片贴附在载玻片的合适位置，于60℃烤箱烤片3h即可。

⑥脱蜡及水化将石蜡切片脱蜡、水化过程，见表16。

表16脱蜡过程

⑦染色染色过程，见表17。

表17染色过程

⑧封片风干后中性树胶封片，最后镜检，根据膝关节软骨组织改良Mankin评分对各组大鼠膝关节软骨进行评分，标准见表18。

表18改良Mankin评分标准

2.8Western blot法检测相关蛋白表达

①总蛋白提取；②总蛋白浓度测定；③SDS-PAGE蛋白凝胶电泳；④转膜；⑤封闭；⑥孵育一抗；⑦孵育二抗；⑧显色成像；⑨数据分析。

2.9实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)技术检测相关mRNA含量①软骨组织总RNA提取(按照Solarbio/索莱宝总RNA提取试剂盒说明书提取)。

②总RNA浓度测定。

③各组总RNA逆转录合成cDNA按照检测的总RNA的浓度，将总RNA样本浓度稀释为500ng/μL。根据反转录试剂盒说明书，进行一下操作步骤：

A去除基因组DNA反应：在冰浴的无RNase的离心管中加入如下反应成分，见表19。

表19去除基因组DNA反应体系

反应条件：42℃2min或室温5min，可延长至30min，4℃终止。

B逆转录反应：反应液配制均在冰上进行。轻柔混匀后立即进行反转录反应，具体反应体系见表20。将合成的cDNA保存于-20℃中冰箱中备用。

表20逆转录反应体系

反应条件下：37℃15min，85℃5s，4℃终止。

C实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)

引物均由上海生工生物工程有限公司设计合成，引物序列见表21；根据说明书进行qRT-PCR检测，具体反应体系见表22。

表21基因扩增引物序列表

表22qRT-PCR检测反应体系

反应条件：50℃ 2min，95℃ 10min；95℃ 30sec，60℃ 30sec，40cycles。绘制溶解曲线，最终数据以2-△△Ct进行分析。

2.10统计方法

本研究所得数据均采用SPSS24.0统计软件处理，计量资料以

3结果

3.1一般情况观察

实验期间对照组大鼠饮食、水正常、反应灵敏、精神状态良好、活动如常；模型组大鼠饮食减少、饮水正常、活动减少、灵敏度及精神状态明显变差，造模侧膝关节出现肿胀、畸形、肢体血液循环变差、肌肉萎缩；通痹健骨方低、中、高干预组与模型组比较，大鼠饮食、饮水、活动情况、灵敏度及精神状态明显好转，造模侧膝关节肿胀程度、肢体血液循环、肌肉萎缩程度均较模型组明显改善，其中通痹健骨方中剂量组最显著。

3.2各组大鼠右后膝关节直径变化情况

造模前各组无差异(P>0.05)；造模4周后，与对照组比较，模型组、通痹健骨方低、中、高剂量组大鼠右后膝关节直径显著变大(P<0.01)，模型组与通痹健骨方低、中、高剂量组相比无显著差异(P>0.05)；治疗4周后，与对照组相比，模型组大鼠右后膝关节直径显著变大(P<0.05)；与模型组比较，通痹健骨方中剂量组膝关节直径显著变小(P<0.01)，通痹健骨方低、高剂量组与模型组相比无显著差异(P>0.05)，见表23、图1。

表23各组大鼠不同阶段右后膝关节直径变化(

注：*P<0.05,**P<0.01,vs.对照组；

图1为各组大鼠不同阶段右后膝关节直径变化分析图(n＝10)。其中，

3.3各组大鼠右后膝关节大体观察

对照组软骨表面光滑、色泽清亮透明，软骨无缺损，无新生物形成；模型组膝关节软骨表面粗糙、色泽暗淡无光，关节边缘形成骨性增生物；通痹健骨方低、中、高剂量组较模型组改善，软骨表面欠光滑，色泽稍暗淡、透明度降低，软骨缺损、骨赘较模型组减少，其中通痹健骨方中剂量组改善最显著，见图2。将各组膝关节软骨大体观察评分进行分析后发现，与对照组比较，模型组评分显著升高(P<0.01)；给予通痹健骨方治疗4周后，通痹健骨方中剂量组评分显著降低(P<0.05)，通痹健骨方低、高剂量组与模型组比较无统计学意义，但较模型组评分降低了，见表24、图3。

图2为各组大鼠膝关节大体观察图。

表24各组大鼠膝关节大体观察评分(

注：*P<0.05,**P<0.01,vs.对照组；

图3为大鼠膝关节大体观察评分。其中，*P<0.05,**P<0.01,vs.对照组；

3.4各组大鼠右后膝关节软骨HE染色及改良Mankin评分结果

对照组大鼠右后膝关节软骨层较厚、表面光滑完整，无裂隙，软骨细胞呈圆形或椭圆形，水平整齐排列，大小均匀饱满，基质着色均匀，潮线完整、清晰可见；模型组大鼠膝关节软骨粗糙不光滑，软骨层变薄，软骨边缘破坏严重，呈退行性改变，软骨细胞明显减少，细胞排列紊乱，细胞簇集，核浓缩，基质染色变浅，潮线紊乱、不规则；通痹健骨方中剂量组较模型组软骨增厚，软骨表面较光滑，染色加深且着色均匀，偶有裂隙，软骨细胞数量显著增多，排列稍紊乱，细胞饱满，形态趋于正常，潮线可见，相对完整；通痹健骨方低、高剂量组较通痹健骨方中剂量组软骨结构相对较差，软骨细胞分布不均，关节软骨表面欠光滑，见图4。各组大鼠右后膝关节改良Mankin评分结果示，与对照组比较，模型组大鼠右后膝关节改良Mankin评分显著升高(P<0.01)；与模型组比较，通痹健骨方中剂量组大鼠右后膝关节改良Mankin评分显著降低，(P<0.01)，通痹健骨方低、高剂量组较模型组无显著差异(P>0.05)，见图5。

图4为各组大鼠右下肢膝关节软骨HE染色(×100)。其中，A：对照组；B：模型组；C：通痹健骨方低剂量组；D：通痹健骨方中剂量组；E：通痹健骨方高剂量组。

图5为改良Mankin评分。注：*P<0.05,**P<0.01,vs.对照组；

3.5各组大鼠软骨组织中IL-1β、TNF-αmRNA表达情况

模型组较对照组IL-1β、TNF-αmRNA表达显著升高(P<0.01)，通痹健骨方低、中、高剂量组较模型组IL-1β、TNF-αmRNA表达显著降低(P<0.01)，其中通痹健骨方中剂量组最显著，见图6。

图6为各组大鼠软骨组织中IL-1β、TNF-αmRNA的表达情况。其中，A：IL-1βmRN A表达统计图；B：TNF-αmRNA表达统计图；*P<0.05,**P<0.01,vs.对照组；

3.6各组大鼠膝关节软骨外基质代谢情况

WB检测结果示，与对照组比较，模型组Aggrecan、CollageⅡ、TIMP1蛋白表达显著降低(P<0.01,P<0.05)，MMP13表达显著升高(P<0.05)；与模型组比较，通痹健骨方低、中剂量组Aggrecan、CollageⅡ、TIMP1蛋白表达显著升高(P<0.01,P<0.05)，其中通痹健骨方中剂量组最显著，通痹健骨方高剂量组无显著差异(P>0.05)，通痹健骨方中剂量组较模型组MMP13表达显著降低(P<0.05)，通痹健骨方低、高剂量组无显著差异(P<0.05)，见图7。Aggrecan、CollagenⅡ、TIMP1、MMP13 mRNA表达与蛋白表达趋势一致，见图8。

图7为各组关节软骨中Aggrecan、CollagenⅡ、TIMP1、MMP13蛋白表达情况。其中，A：对照组；B：模型组；C：通痹健骨方低剂量组；D：通痹健骨方中剂量组；E：通痹健骨方高剂量组；F:Aggrecan蛋白相对表达统计图；G:CollagenⅡ蛋白相对表达统计图；H：TIMP1蛋白相对表达统计图；I：MMP13蛋白相对表达统计图；*P<0.05,**P<0.01,vs.对照组；

图8为各组大鼠软骨组织中Aggrecan、CollagenⅡ、TIMP1、MMP13 mRNA的表达情况。其中，A：Aggrecan mRNA表达统计图；B：CollagenⅡmRNA表达统计图；C：TI MP1 mRNA表达统计图；D：MMP13 mRNA表达统计图；*P<0.05,**P<0.01,vs.对照组；

3.7各组大鼠膝关节软骨中自噬相关蛋白LC3、P62表达情况

与对照组比较，模型组LC3Ⅱ/LC3I比值显著降低，P62蛋白表达显著升高(P<0.01)；与模型组比较，通痹健骨方中剂量组LC3Ⅱ/LC3I比值显著升高，P62蛋白表达显著降低(P<0.01)，通痹健骨方低、高剂量组与模型组相比无显著差异(P>0.05)，见图9。LC3、P62基因表达与蛋白表达趋势一致，见图10。

图9为各组关节软骨中自噬相关蛋白表达情况。其中，A：对照组；B：模型组；C：通痹健骨方低剂量组；D：通痹健骨方中剂量组；E：通痹健骨方高剂量组；F：LC3Ⅱ/LC3I比值统计图；G：P62蛋白相对表达统计图；*P<0.05,**P<0.01,vs.对照组；

图10为各组大鼠软骨组织中LC3、P62 mRNA表达情况。其中，A：LC3 mRNA表达统计图；B：P62 mRNA表达统计图；*P<0.05,**P<0.01,vs.对照组；

3.8各组大鼠膝关节软骨中P-AMPK、P-mTOR、P-ULK1表达情况

模型组较对照组P-AMPK、P-ULK1蛋白表达显著降低(P<0.01,P<0.05)，P-mTOR表达显著升高(P<0.01)；与模型组比较，通痹健骨方中剂量组P-AMPK蛋白表达显著升高(P<0.05)，通痹健骨方低、高剂量组无显著差异(P>0.05)，通痹健骨方低剂量组、通痹健骨方中剂量组P-ULK1蛋白表达显著升高(P<0.01)，其中通痹健骨方中剂量组最显著，通痹健骨方高剂量组无显著差异(P>0.05)，通痹健骨方中剂量组P-mTOR蛋白表达显著降低(P<0.05)，通痹健骨方低、高剂量组无显著差异(P>0.05)，见图11。AMPK、mTOR、ULK1基因表达与蛋白表达趋势一致，见图12。

图11为各组关节软骨中P-AMPK、P-mTOR、P-ULK1表达情况。其中，A：对照组；B：模型组；C：通痹健骨方低剂量组；D：通痹健骨方中剂量组；E：通痹健骨方高剂量组；F：P-AMPK蛋白相对表达统计图；G：P-mTOR蛋白相对表达统计图；H：P-ULK1蛋白相对表达统计图；*P<0.05,**P<0.01,vs.对照组；

图12为各组大鼠软骨组织中AMPK、mTOR、ULK1 mRNA表达情况。其中，A：AM PK mRNA表达统计图；B：mTOR mRNA表达统计图；C：ULK1 mRNA表达统计图；*P<0.05,**P<0.01,vs.对照组；

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。