肝素五糖化合物在制备治疗病毒性出血热的药物中的应用

摘要

本发明提供了一种肝素五糖化合物在制备治疗病毒性出血热药物中的应用，所述化合物能降低病毒性出血热的死亡率，改善病毒性出血热的病生理改变，抑制疾病发展过程中的器官损伤。

说明书

技术领域

本发明属于药物化合物制药技术领域，具体涉及一种肝素五糖化合物在制备治疗病毒性出血热的药物中的应用。

背景技术

自20世纪30年代以来，世界上陆续发现了十多种以发热、出血和休克为主要临床特征的病毒性疾病。经过病毒学家、临床医学家、流行病学家和病理生理学家的共同努力，发现这些不同的出血性疾病虽然病原体的种类不同，但从发病学上是一组疾病，从而“病毒性出血热”作为一组疾病的总称被确立并广泛使用。

这组疾病可根据病原学的不同进行分类。从病原学角度分类，目前已确立了至少13种病毒性出血热的病原体：披膜病毒科(其阿尔法病毒属引起基孔肯雅出血热，黄病毒属引起黄热病、鄂木斯克出血热、登革出血热、科萨努尔森林病)；布尼亚病毒科(内罗病毒属引起克里米亚-刚果出血热，汉坦病毒属引起流行性出血热，白蛉病毒属引起李夫特山谷热)；沙病毒科沙病毒属(引起阿根廷出血热、玻利维亚出血热、拉沙热)；丝状病毒科丝状病毒属(引起埃博拉出血热、马尔堡出血热)等。

病毒性出血热常见的临床特征是早期的发热，其全身性的体征和症状与流感和疟疾相似，随后出现出血，包括皮下出血(例如出血点、淤血、穿刺部位渗血、鼻衄、牙龈出血、出血性结膜炎)、内脏出血(例如呕血、黑便、血尿、阴道出血等)，出血程度会因病而异。严重的病毒性出血热会累及心血管系统，导致可逆或不可逆的休克综合征，并很快出现其他并发症，如脱水、肾功能衰竭、肝功能衰竭、溶血、黄疸、酸中毒、中枢神经系统受累和继发性细菌感染等。另一方面，病毒感染也可能直接导致器官损伤，比如出现肝脏、肾脏、心脏、脾脏等脏器的点状坏死，炎性细胞浸润等。局部病理改变和全身性的病生理改变在疾病发展过程中会并行且相互促进。因此病毒性出血热的病死率也因病而异，例如基孔肯雅出血热的病死率很低，黄热病病死率小于5％，流行性出血热小于10％，克里米亚-刚果出血热为10～50％，埃博拉出血热则可高达80％以上。

病毒性出血热作为一组疾病，其病原不同，流行病学特点也不同，有些是虫媒传播(蚊子、蜱、白蛉、蠓)，有些是啮齿类动物传播，有些还未明确传播途径，虽然发病率远不如流感、疟疾等，但其流行潜力、相对高的病死率和预防治疗异常困难，仍然给公共卫生造成了特殊问题。

目前人类对病毒性病原体仍然缺乏有效的治疗药物，因此对病毒性出血热的治疗也是以对症和综合治疗为主，包括退热、补液、止血、应用糖皮质激素，治疗休克等。而由于患者存在出血倾向，退热不能使用会导致出血的阿司匹林等药物。

在预防方面，各类型疫苗是常用手段之一，包括灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗等，能够提供一定的保护作用。以克里米亚-刚果出血热(Crimean-Congohemorrhagic fever，CCHF)为例，目前开发了CCHFV灭活疫苗和减毒活疫苗(细胞来源的灭活疫苗可以避免引起接种者自身免疫和过敏反应，副作用较小，但病毒的结构蛋白在灭活过程中的空间构象往往受到破坏，进而可能影响其免疫学特性并致使其刺激机体特异性免疫应答能力减弱；而减毒活疫苗与灭活疫苗相比，疫苗本身免疫力强，但具有潜在的致病危险)、CCHFV亚单位疫苗(虽然目前关于CCHFV亚单位疫苗的研究取得了进展，但是也遇到了一些瓶颈问题，例如如何提高CCHFV抗原蛋白尤其是GP的表达量，如何有效分泌和正确修饰重组抗原蛋白，如何纯化并保持抗原蛋白活性以及如何增强其刺激机体的免疫应答能力等等，若能有效解决这些问题将会大大促进CCHFV亚单位疫苗的进一步发展)、CCHFV核酸疫苗(CCHFV核酸疫苗研究虽然表现出良好的应用前景，但是缺陷在于该疫苗主要表达内源性抗原蛋白，单纯活化主要组织相容性复合体Ⅰ类抗原提成加工途径并诱导以CTL为主的特异性细胞免疫应答，同时由于注射方式的缺陷导致DNA疫苗往往不能有效的进入细胞内而过早被体内的核酸酶降解)、CCHFV病毒活载体疫苗(虽然活载体疫苗可有效地刺激机体产生特异性免疫应答，并保护动物免受病毒的攻击，但是其最大的缺点是接受疫苗接种的个体体内预先存在的抗病毒载体抗体会影响活载体疫苗的免疫效果)、CCHFV病毒样颗粒疫苗(病毒样颗粒疫苗(virus-like particle，VLP)作为基因工程候选疫苗，已经广泛应用于其他病毒疫苗的研制。但其主要缺陷在于其作为一种外源重组蛋白不能持续性刺激机体的免疫反应，同时刺激机体的细胞免疫应答能力不强。此外在VLP疫苗研制工作中最关键的问题在于如何大量表达和纯化VLP，因此选择一种合适的表达系统显得尤为重要)。

仍然需要开发能够治疗病毒性出血热的药物，尤其是能改善患者出血倾向和症状，从而改善病情发展，不发生心血管累及而导致的休克以及一系列后续病生理变化，降低死亡率。

发明内容

本发明提供一种肝素五糖类化合物，所述化合物能够治疗病毒性出血热，避免出血热疾病发展过程中的各种器官损伤，降低死亡率。

所述肝素五糖类化合物的结构如下式A结构(从左到右的5个单糖分别用D、E、F、G、H来表示)：

其中每个Y相同或不同，独立的选自H，Na

优选，所述每个Y都相同，选自H，Na

优选，所述每个Y相同或不同，独立的选自Na

在本发明的一个实施方式中，所述每个Y都相同，选自Na

本领域技术人员可以理解，任一个或两个或以上个Y选自Na

所述式A化合物是具有单一光学活性的化合物，即GlcNS6S(1→4)GlcA3Sβ(1→4)GlcNS3S6S(1→4)IdoA2S(1→4)GlcNS6S，并且H糖端基甲酯为α构型。

在本发明的一个实施方式中，Y为H，所述化合物的结构式如下，在本发明中以CV001指代。

在本发明的一个实施方式中，Y为Na

在本发明的一个实施方式中，Y为K

由于式A化合物(例如CV122)具有微弱的抗凝活性，引起出血的风险极低，其在治疗病毒性出血热时，可以在疾病早期即用药。

本发明提供式A化合物或其溶剂化物在制备治疗病毒性出血热的药物中的应用。

根据本发明，所述病毒性出血热是由病毒感染引起的，以发热、出血和休克为特征的疾病，其包括但不限于基孔肯雅出血热、黄热、鄂木斯克出血热、登革出血热、科萨努尔森林病、克里米亚-刚果出血热、流行性出血热、李夫特山谷热、阿根廷出血热、玻利维亚出血热、拉沙热、埃博拉出血热、马尔堡出血热。

本发明的发明人利用病毒性出血热动物模型研究发现，所述化合物能够降低病毒性出血热动物模型小鼠的死亡率，并观察到所述化合物对病毒性出血热动物模型小鼠的脏器有保护作用，降低了疾病发展过程中出现的器官组织结构和功能损伤。

本发明提供式A化合物或其溶剂化物在制备保护病毒性出血热患者的器官的药物中的应用。在本发明的一些实施方式中，所述的器官包括但不限于脾脏、心脏、肺脏、肝脏和/或肾脏。所述保护器官(或脏器)包括但不限于减轻器官的组织损伤，例如，减少器官内细胞的坏死，减少器官内发生的出血，减少器官内炎症细胞的浸润，从而保护或维持器官功能。

本发明提供式A化合物或其溶剂化物在制备保护病毒性出血热患者的血管内皮或其细胞的药物中的应用。

本发明提供式A化合物或其溶剂化物和其他的治疗病毒性出血热的药物联合在制备治疗病毒性出血热的药物中的用途。

本发明提供式A化合物或其溶剂化物在制备和其他的治疗病毒性出血热的药物联合治疗病毒性出血热的药物中的用途。

在本发明的一个实施方式中，式A化合物是CV001。

在本发明的一个实施方式中，式A化合物是CV122。

在本发明的一个实施方式中，式A化合物是CV123。

式A化合物结构明确，利于制备和质量控制，且不与其他蛋白相结合，体内半衰期长，在双室模型中t

本发明进一步提供一种药物组合物，其特征在于包括式A化合物，或其溶剂化物作为活性成分。所述药物组合物用于治疗病毒性出血热、保护病毒性出血热患者的器官、保护病毒性出血热患者的血管内皮或其细胞。

所述药物组合物进一步含有药学上可接受的载体。

所述药学上可接受的载体是制药领域中常用或已知的各种辅料，包括但不限于：稀释剂、粘合剂、抗氧化剂、pH调节剂、防腐剂、润滑剂、崩解剂等。

所述稀释剂例如：乳糖、淀粉、纤维素衍生物、无机钙盐、山梨醇等。所述粘合剂例如：淀粉、明胶、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮等。所述抗氧化剂例如：维生素E、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、丁羟基茴香醚等。所述pH调节剂例如：盐酸、氢氧化钠、柠檬酸、酒石酸、Tris、乙酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等。所述防腐剂例如：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、间甲酚、苯扎氯铵等。所述润滑剂例如：硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉等。所述崩解剂例如：淀粉、甲基纤维素、黄原胶、交联羧甲基纤维素钠等。

所述药物组合物中含有式A化合物的量(以式A化合物计)为0.1-1000mg，优选1-500mg，更优选为5-100mg。

所述药物组合物中式A化合物(以式A化合物计)占药物组合物的质量百分比为0.01％-95％，根据剂型不同例如可以为0.1％-10％，0.3～5％，或者10％-90％，优选为20％-80％，更优选为30％-70％等含量范围。

所述药物组合物的剂型可以是口服剂的形式，例如片剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒剂、悬浮剂、糖浆剂等；也可以是注射给药的剂型，例如注射液、粉针剂等，通过静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内的途径注射给药。所有使用的剂型形式都是药学领域普通技术人员所熟知的。例如所述药物组合物可以为注射液，式A化合物在注射液中的浓度可以为1-15mg/ml，例如5mg/ml、10mg/ml、12.5mg/ml等。

所述药物组合物的施用途径包括但不限于：口服的；含服的；舌下的；透皮的；肺的；直肠的；肠胃外的，例如，通过注射，包括皮下的、真皮内的、肌内的、静脉内的；通过植入储库或储液器。

式A化合物的施用剂量(以式A化合物计)将取决于接受者的年龄、健康和体重，联用药物的种类，治疗频率，给药途径等。药物可以单一日剂量施用，每天给药一次、每两天给药一次、每三天给药一次、每四天给药一次，或者总日剂量以每天两次、三次或四次的分开剂量施用。式A化合物用药量(以式A化合物计)为0.01-100mg/kg/天，优选为0.1-10mg/kg/天，例如为0.5mg/kg/天，1mg/kg/天、2mg/kg/天、5mg/kg/天等等。

所述药物组合物可以和其他的治疗病毒性出血热、保护病毒性出血热患者的器官、保护病毒性出血热患者的血管内皮或其细胞的药物联合应用。

所述药物组合物可以进一步含有第二种治疗剂，所述第二种治疗剂是其他的治疗病毒性出血热、保护病毒性出血热患者的器官、保护病毒性出血热患者的血管内皮或其细胞的药物。

本发明提供一种治疗病毒性出血热的方法，其特征在于，对有需要的患者施用治疗有效量的式A化合物、或其溶剂化物。

本发明提供一种保护病毒性出血热患者的器官的方法，其特征在于，对有需要的患者施用治疗有效量的式A化合物、或其溶剂化物。

本发明提供一种保护病毒性出血热患者的血管内皮或其细胞的方法，其特征在于，对有需要的患者施用治疗有效量的式A化合物、或其溶剂化物。

所述式A化合物、或其溶剂化物的施用途径包括但不限于：口服的；含服的；舌下的；透皮的；肺的；直肠的；肠胃外的，例如，通过注射，包括皮下的、真皮内的、肌内的、静脉内的、动脉内的；通过植入储库或储液器。

所述方法进一步包括，对有需要的患者给予其他的治疗病毒性出血热的药物。

其他的治疗病毒性出血热的药物包括但不限于：抗病毒剂(例如利巴韦林、法匹拉韦、氯喹等)、单克隆抗体、血容量扩充剂、血管活性药物、糖皮质激素、血制品(例如康复期患者血清)、抗凝药等。

式A化合物可以采用本领域已知的肝素五糖合成方法，例如4+1的合成策略，或3+2合成策略等。

在本发明的一个实施方式中，以3+2的合成路线进行，选用不同于现有技术的三糖供体离去基、不同的羟基保护基策略，以及不同的单糖模块合成方法，以全保护五糖中间体1，依次经过脱羟基和羧基保护基，磺酸化和叠氮还原，最后再经磺酸化得到式A化合物：

所述脱羟基和羧基保护基、磺酸化和叠氮还原都可以采用本领域已知的反应方法和条件进行。

中间体1中R

所述全保护五糖中间体1可以由三糖中间体2和二糖受体3发生糖基化反应得到，反应式如下：

所述糖基化反应可采用本领域已知的方法进行。在本发明的一些实施方式中，所述反应温度为-10℃～-25℃。所述反应可以在强酸条件下进行，所述强酸例如三氟甲磺酸、TBSOTf、TMSOTf等。

所述三糖中间体2，可以通过单糖中间体7和二糖中间体8通过(1→4)糖苷键偶联得到立体构型专一的三糖中间体4，三糖中间体4的1，6开环得到三糖中间体5，再得到三糖中间体2，反应式如下。所述各反应步骤可采用本领域已知方法进行。在本发明的一些实施方式中，在有机溶剂中酸性条件下进行单糖中间体7和二糖中间体8合成三糖中间体4的反应，反应温度为-10℃～-25℃。所述有机溶剂可以选自苯、甲苯、二氯甲烷等。所述酸性条件可通过加入TfOH、TMSOTf或TBSOTf等酸性物质形成。在本发明的一些实施方式中，在相应的酸酐(例如氯乙酸酐、乙酸酐、苯甲酸酐、特戊酸酐)中进行三糖中间体4的1，6开环得到三糖中间体5，加入TBSOTf、TMSOTf、Et

二糖中间体8可以由单糖10和11糖基化反应后，分离其中β构型的产物得到，反应式如下：

在本发明的一些实施方式中，可以采用Ag

所述单糖10可以葡萄糖为原料，经过包括如下步骤的反应制备得到：1)将葡萄糖1位羟基转化为硫苷；2)将葡萄糖的4位和6位羟基保护后，用临时保护基保护3位羟基，再用苄基保护2位羟基，之后脱掉所述临时保护基换用R

上述制备方法中用到的单糖11、单糖7、二糖受体3可以按照本领域已知的合成方法制备，例如：Preactivation-based,iterative one-pot synthesis of anticoagulantpentasaccharide fondaparinux Sodium.Org.Chem.Front.,2019,6,3116；TotalSynthesis of Anticoagulant Pentasaccharide Fondaparinux.ChemMedChem,2014,9,1071–1080。

上述制备方法中各中间体化合物中R

附图说明

图1病毒性出血热小鼠模型中CV122给药后小鼠存活情况

图2病毒性出血热小鼠模型中CV122给药后小鼠脾脏和肝脏组织HE染色结果

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

Ac：乙酰基；AgOTf：三氟甲磺酸银；Bn：苄基；Bz：苯甲酰基；ClAc：单氯乙酰基；CSA：樟脑磺酸；Cbz：苄氧基羰基；CsF：氟化铯；DBU：1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯；DCM：二氯甲烷；DDQ：2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌；DMF：N,N-二甲基甲酰胺；PMB：对甲氧基苄基；TfOH：三氟甲磺酸；TBSOTf：叔丁基二甲硅基三氟甲磺酸酯；TEMPO：2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物；TMSOTf：三氟甲磺酸三甲基硅酯；Tol：甲苯。

实施例1五糖中间体III的合成

1、单糖中间体10-1的制备方法

以葡萄糖12为起始原料，经全乙酰化获得单糖中间体13；在BF

各步骤反应条件以及收率如下：a)Ac

2、二糖中间体9-1的制备方法

单糖中间体10-1和单糖中间体11-1在不溶性碳酸银和催化量三氟甲磺酸银的作用下，反应过夜生成二糖中间体9-1，经NMR鉴定，产物α/β比例大约为1:1。

两口瓶中加入

HRMS[M+Na]

3、二糖中间体8-1的制备方法

将二糖中间体9-1的4位氯乙酰基脱除，将α构型的产物分离出去，得到纯净的β构型二糖中间体8-1。

将上述二糖中间体9-1溶于15mL的三氯甲烷和甲醇(V/V＝1:1)的混合溶剂中，加入硫脲(192mg,2.52mmol)加热到60℃，点板监测，原料消失完全且生成三个单点时停止加热，冷却至室温，加入适量硅胶旋干，直接柱层析分离(石油醚/乙酸乙酯＝1:1)得到无色泡沫状二糖中间体8-1(583mg，两步产率42％)。

HRMS[M+Na]

4、三糖中间体2-1-1的制备方法

单糖中间体7-1与二糖中间体8-1糖基化偶联得到立体构型专一的三糖中间体4-1；乙酰解得到1,6开环的三糖中间体5-1；在苄胺作用下脱掉端基乙酰基得到三糖中间体6-1，然后上三氯乙酰亚胺酯得到三糖中间体2-1-1。

三糖中间体4-1的制备方法：两口瓶中加入

HRMS[M+K]

三糖中间体5-1的制备方法：将三糖中间体4-1(370mg,0.39mmol)溶于10mL乙酸酐中，氮气保护，冰浴冷却至0℃，逐滴加入TBSOTf(38μL,0.16mmol)，维持在低温条件下反应20min后，TLC监测原料反应完全，加入三乙胺淬灭反应。将反应液减压浓缩，所得粗品直接柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝5:1)，得到无色油状产物三糖中间体5-1(409mg,100％)。

HRMS[M+Na]

三糖中间体2-1-1的制备方法：将三糖中间体5-1(100mg,0.094mmol)溶于5mL的THF中，加入苄胺(51μL，0.47mmol)室温反应，TLC监测反应完全后，将反应液转到分液漏斗中，用1N盐酸将剩余苄胺洗走，水相用乙酸乙酯回萃两次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，抽滤，减压浓缩后所得粗品直接柱层析纯化得到三糖中间体6-1。将上述三糖中间体6-1溶于5mL的二氯甲烷中，加入无水碳酸钾(19mg,0.14mmol)，室温下逐滴加入三氯乙腈(14μL,0.14mmol)。加完后，反应液在室温下搅拌2h，TLC监测原料基本反应完全，用一小段硅胶将碳酸钾滤走，滤液减压浓缩，所得粗品直接柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝5:1)得到无色糖浆三糖中间体2-1-1(79mg,两步产率72％)。通过硅胶柱层析可以分离得到α构型和β构型两个构型，以下是两种构型的核磁数据。

混合构型的中间体2-1-1可以直接用于下一步反应得到α构型的全保护化合物1-1，或者将中间体2-1-1分离得到的α构型和β构型两个构型分别投入下一步均能得到α构型的全保护化合物1-1，即后续合成中无论使用哪种构型或混合构型的中间体2-1-1，都不影响后续反应和产率。

β构型的产物核磁：

HRMS[M+Na]

α构型的产物核磁：

5、全保护五糖中间体1-1的制备方法

三糖的三氯乙酰亚胺酯供体三糖化合物2-1-1和二糖中间体3-1在三氟甲磺酸的催化下，生成全保护五糖中间体1-1。

两口瓶中加入

HRMS[M+Na]

6、五糖中间体III-1的制备方法

全保护五糖1-1在LiOH、H

五糖中间体III-1的制备方法：全保护的五糖中间体1-1(100mg,0.054mmol)溶于4.9mL THF后，依次滴加1.3mL 1.25N LiOH溶液和2.7mL 30％H

HRMS[M-2Na]

实施例2化合物CV001的制备

CV001的制备方法：取实施例1制备的五糖中间体III-1(200mg,0.13mmol)溶于2mL水，滴加2N的NaOH溶液调节pH在9-10之间(并在下面的反应中不断滴加2N的NaOH维持pH在9-10之间)加入SO

HRMS[M–3H]

实施例3化合物CV122的合成

合成方法1：将化合物CV001进行钠交换后可以得到钠盐CV122。

将CV001溶于水后，用水过Dowex-50-WX4-Na

合成方法2：取实施例1制备的五糖中间体III-1(200mg,0.13mmol)溶于2mL水，滴加2N的NaOH溶液调节pH在9-10之间(并在下面的反应中不断滴加2N的NaOH维持pH在9-10之间)加入SO

HRMS[M–3Na]

实施例4化合物CV123的合成

合成方法1：将化合物CV001进行钾交换后可以得到钾盐CV123。

将CV001溶于水后，用水过Dowex-50-WX4-K

合成方法2：取实施例1制备的五糖中间体III-1(137mg,0.09mmol)溶于2mL水，滴加2N的NaOH溶液调节pH在9-10之间(并在下面的反应中不断滴加2N的NaOH维持pH在9-10之间)加入SO

以下实施例中以CV122为例，说明式A化合物的治疗活性。CV122由实施例3的合成方法2制备得到。

实施例5CV122对病毒性出血热的治疗效果

使用干扰素α/β受体(IFNAR

实验小鼠分两组：(1)对照组(给药0.9％NaCl)：雄鼠5只(7-8周IFNAR

病毒感染小鼠：腹腔注射CCHFV，每只5000TCID

待实验结束，处死存活小鼠取其肝脏和脾脏进行组织制片和HE染色，进行病理检查。

所述组织的HE染色结果见图2。从图2可见，对照组小鼠脾脏出血、水肿；白、髓质界限消失，脾小体结构崩解，淋巴细胞坏死，数量显著减少；髓质部分巨噬细胞、单核淋巴细胞增生；肝组织中偶见肝细胞片状凝固性坏死，糖原耗尽胞浆均质、红染，核固缩；并伴有明显的炎细胞浸润。而治疗组小鼠，脾脏充血和水肿情况略微减轻；白、髓质界限模糊，脾小体变小甚至消失，淋巴细胞坏死的数量显著减少；髓质部分巨噬细胞、单核淋巴细胞增生，整体病变程度比对照组略轻；肝脏病变程度与对照组无明显区别。

实施例6CV122的抗凝活性

1、实验原理

肝素(Heparin)先与过量的ATIII生成复合物(AT-Hep.)，理论上认为肝素全部生成了具有抑制凝血酶活性的AT-Hep.复合物。AT-Hep.复合物再与过量的FXa结合，剩余的游离FXa可以水解底物S

Heparin+AT III→[AT-Hep.]

[AT-Hep.]+[FXa(excess)]→[FXa-AT-Hep.]+[residual FXa]

[residual FXa]+Substrate→Peptide+pNA

2、测试方法

活性测试所需要的ATIII，FXa，和显色底物S

按照下表分别配制相应溶液：

低分子肝素钠标准品/样品准备：标准品或者样品均稀释至1.0IU/ml(起始剂量在药典范围内可以适当调整)，然后分别稀释至A-E五个浓度梯度[A]0.1600(或0.2/0.18都可)IU/ml×0.75＝[B]0.1200IU/ml×0.75＝[C]0.0900IU/ml×0.75＝[D]0.0675IU/ml×0.75＝[E]0.0506IU/ml，按照下表操作顺序加样，然后酶标仪读取450nm处的OD值，用bs2000软件应用量反应平行线4.4法计算效价。

酶活测定操作顺序

3、经测定：

CV122测得效价PT＝119.96IU/mg，效价的可信限率为FL＝4.6284％；

磺达肝癸钠(天津市红日药业股份有限公司提供)测得效价PT＝923.01IU/mg，效价的可信限率为FL＝6.014％。

效价越大，抗凝活性越好。由上述实验可见，CV122的抗凝活性低于磺达肝癸钠。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。