一种特异性抑制P-gp逆转肿瘤多药耐药的粉防己碱简化物及制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种特异性抑制P‑gp逆转肿瘤多药耐药的粉防己碱简化物及制备方法和应用，其特异性抑制P‑gp逆转肿瘤多药耐的粉防己碱简化物，具有如下通式结构：

说明书

技术领域

本发明涉及医药化学领域，特别涉及一种特异性抑制P-gp逆转肿瘤多药耐药的粉防己碱简化物及制备方法和应用。

背景技术

多药耐药(Multidrug resistance，MDR)是恶性肿瘤在接触一种抗癌药物后，继而对多种结构不同、作用机制各异的其他抗癌药产生耐药性。MDR在长期化疗中常常出现，极大地降低了化疗的疗效，也是大多数转移性肿瘤化疗失败的主要原因。由ABC转运蛋白引起的药物外排增加是MDR的重要成因。P-糖蛋白(P-gp；ABCB1；MDR1)是最典型和常见的ABC转运蛋白，常在癌细胞中过表达，用于转运抗癌药物以降低细胞内治疗浓度。抑制P-gp功能，抗癌药物在细胞内的积累增加并恢复杀伤癌细胞的有效治疗浓度，因此，发现高效的P-gp抑制剂并与传统化疗药物共同给药，长期以来被认为是有效的逆转临床多药耐药的策略。

迄今为止，药物化学家已经开发了数十种P-gp抑制剂，但由于药效、毒性、特异性、药物-药物相互作用不良等原因，目前尚无P-gp抑制剂获批临床使用。以粉防己碱为代表的天然异喹啉生物碱具有广泛的生物活性，包括抗炎、抗肿瘤、抗氧化应激等，也被报道为MDR逆转药的主要支架。然而，异喹啉类生物碱与其他天然产物一样，存在药效有限、溶解度差、代谢不稳定、毒理学性质不佳等缺点。更重要的是，其结构的复杂性导致合成困难，难以优化以满足成药性需求。以往的对粉防己碱的结构改造只是在天然粉防己碱上做一些简单修饰，产物结构较为单一，活性提升有限，并且没有改变粉防己碱难以通过化学全合成的痛点。不仅如此，传统的逆转肿瘤耐药筛选评价体系多利用测定细胞活度的方法进行，费时费力，迫切需要建立更加便捷的筛选评价体系。

因此，对以粉防己碱为代表的异喹啉生物碱进行合理结构简化，建立一种有效的异喹啉生物碱衍生物合成方法及逆转肿瘤耐药筛选评价体系，并从中获取高效、低毒、高选择性的P-gp抑制剂，对于肿瘤多药耐药的联合用药治疗具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性抑制P-gp逆转肿瘤多药耐药的粉防己碱简化物及制备方法和应用。所述简化物能高效逆转胃癌、肺癌、食管癌等多种实体肿瘤细胞的多药耐药，该化合物具有较低的细胞毒性，能特异性地抑制介导肿瘤细胞多药耐药的关键外排泵蛋白P-gp(P-glycoprotein，P-糖蛋白)，所述简化物与长春新碱、米托蒽醌、秋水仙碱、多西他赛等多种化疗药物联用，在体内外均能高效逆转肿瘤多药耐药，这类特异性P-gp抑制剂作为抗肿瘤化疗增敏剂，提供了一种替代策略，可作为先导化合物用于新型耐药肿瘤逆转剂的研发。

所述简化物经热迁移实验证明能够稳定P-gp蛋白，经肿瘤细胞毒性实验和动物荷瘤实验证明在体内外均具有优异的逆转肿瘤多药耐药活性且自身具有较低的细胞毒性。

本发明所述的特异性抑制P-gp逆转肿瘤多药耐的粉防己碱简化物，具有如下通式结构：

其中：R

R

n＝0时，R

n＝1时，R

所述

所述-OR

本发明采用在有机溶剂中，取代苯乙胺与取代苯乙酸在硼酸催化下，回流缩合成酰胺中间体I；而后在三氯氧磷作用下，回流脱水环合成亚胺中间体II；再经硼氢化钠还原为仲胺中间体III；仲胺中间体III经还原胺化或者NH-经卤代烃取代得到最终产物IV。

本发明所述简化物的制备方法，有以下步骤：

1)将11mmol取代苯乙胺与11mmol取代苯乙酸加入到甲苯溶液中，在0.88mmol硼酸催化下110℃搅拌反应20小时，浓缩除去溶剂，得到反应产物，向所述反应产物中加入乙酸乙酯对其进行2～3次洗涤，之后过滤掉洗涤后的溶液，得到中间体产物Ⅰ；

2)将1)所得中间体Ⅰ加入到二氯甲烷中，然后加入33mmol三氯氧磷，得到反应溶液；将所述反应溶液加热到78℃，搅拌7-8小时，之后用碳酸氢钠水溶液对其进行淬灭直至反应溶液没有大量气泡生成：然后用二氯甲烷对所述反应物进行萃取，得到有机溶剂层，接着用无水硫酸钠干燥，即得到中间体Ⅱ；

3)将2)所得中间体Ⅱ加入到甲醇中，用冰浴进行冷却，加入50mmol硼氢化钠，然后在室温下搅拌5小时，浓缩除去溶剂，加入二氯甲烷，萃取，得到有机溶剂层，接着用无水硫酸钠干燥，得到中间体Ⅲ；

4)中间体III经还原胺化或者卤代烃取代后可在四氢异喹啉的NH-上引入烷基、烯基、环烷基、环烷基烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环基、杂环基烷基、酰基中的任意一种，得到最终产物IV。

本发明所述方法实现了对粉防己碱结构的合理精简优化，改变了传统的单纯在天然粉防己碱结构上做衍生修饰。所制备的粉防己碱简化物，具有操作简单，没有危险的操作，反应所需时间较短，平均只需要两天至三天即可获得最终产物，反应底物适用范围广，产物结构多样，原子经济性好，具有环境友好性且收率也比较可观等优点。采用本发明所述方法制得的粉防己碱简化物具有低细胞毒性、简便的合成方法、良好的水溶性以及优异的逆转肿瘤多药耐药活性，是一类良好的先导物，具备进一步成药开发潜力。

上述粉防己碱简化物与长春新碱、米托蒽醌、秋水仙碱、多西他赛的中一种或多种联合在制备治疗癌症药物中的应用。

所述癌症为肺癌或胃癌或乳腺癌或胰腺癌或前列腺癌或白血病或食管癌。

所述简化物特异性抑制P-gp。

本发明基于分子动力学模拟和片段生长发对天然粉防己碱(TET)进行了合理的结构简化，得到了一个易于制备、具有高逆转活性和低细胞毒性的新型简化物，具有更高的结合自由能，包含所述化合物的立体异构体。

本发明为设计新的特异性P-gp抑制剂作为抗肿瘤化疗增敏剂提供了另一种策略。

本发明所述粉防己碱简化物通过激光共聚焦显微镜、流式细胞术测定P-gp荧光底物在胞内的积累情况，快速筛选粉防己碱简化物逆转肿瘤耐药的活性。实例可见图11和13，通过荧光积累情况快速筛选粉防己碱简化物逆转肿瘤耐药的活性。

采用本发明所制得的产物可以经过柱层析的方法分离，其采用展开剂为极性溶剂，洗脱剂采用非极性溶剂的混合溶剂，推荐溶剂：二氯甲烷/甲醇。

附图说明

图1为受试化合物(OY-101、VRP、TET、NEF、CEP和TQ)处理人正常细胞(LX-2、HK-2、HEK293T、GES-1)、癌细胞(Eca109)和耐药癌细胞(Eca109/VCR)48小时的IC

图2为天然粉防己碱与其简化物物OY-101的水溶性对比；

图3为粉防己碱简化物OY-101逆转肿瘤耐药活性测试；

图4为流式细胞术检测粉防己碱简化物OY-101联用VCR诱导耐药株凋亡；

图5为三次流式细胞术测定统计结果柱状图；

图6为平板克隆形成实验；

图7为亲本株和耐药株的外排泵蛋白表达差异及简化物OY-101对外排泵蛋白表达的影响；

图8为激光共聚焦观察简化物OY-101对P-gp底物的胞内积聚的影响；

图9为简化物OY-101对RH123的胞内积累具有浓度和时间依赖性；

图10为简化物OY-101对四种荧光底物胞内积累情况的影响；

图11为荧光底物与外排泵蛋白的对映情况；

图12为流式细胞术观察简化物OY-101对荧光底物的胞内积累情况；

图13为三次流式细胞术实验的数据统计图；

图14为热稳定性实验证实简化物OY-101与P-gp具有直接结合作用；

图15为简化物OY-101对P-gp特异性和非特异性化疗药物的逆转倍数；

图16为简化物OY-101的体内药效和毒性评价。

图17为流式细胞术观察简化物OY-10联合VCR对乳腺癌细胞凋亡诱导效果；

图18为流式细胞术观察简化物OY-10联用VCR对胃癌细胞凋亡诱导效果；

图19为流式细胞术观察简化物OY-10联用VCR对肺癌细胞凋亡诱导效果；

图20为所述简化物OY-101的立体异构体HPLC色谱图。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明的目的，其不以任何方式限制本发明的范围。

试剂：

苯乙胺、乙酸衍生物、硼酸、三氯氧磷、硼氢化钠、BINAP、甲醛((北京伊诺凯生物科技有限公司)

酸性添加剂为市售分析纯。

本发明中所述水为蒸馏水，所述有机溶剂均为市售分析纯的极性溶剂或非极性溶剂，如：苯、甲苯、二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲醇、四氢呋喃、石油醚、乙酸乙酯等。

实施例1

取一个250ml的圆底烧瓶，将3，4-二甲氧基苯乙胺11mmol、4-三氟甲基苯乙酸11mmol和硼酸0.88mmol依次加入，之后将其溶于120ml的甲苯之中，在150℃回流条件下搅拌反应12小时。之后浓缩除去溶剂，加入30ml的乙酸乙酯对其洗涤2-3次，之后过滤掉洗涤液，得到中间产物Ⅰ(10.91mmol粗品)

将10.91mmol的中间体Ⅰ和33mmol的三氯氧磷加入到120ml的二氯甲烷中得到反应液，将反应液加热到70℃搅拌5小时后冷却，将反应液倒入250ml烧杯中，缓慢加入饱和碳酸氢钠水溶液对其进行淬灭，直至烧杯中气泡不在大量产生，加入30ml二氯甲烷对淬灭后的反应液进行萃取，得到有机相；对有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋去二氯甲烷即得到中间体Ⅱ(9.97mmol粗品)。

取一个250ml圆底烧瓶，将9.97mmol的中间体Ⅱ溶于100ml无水甲醇中，然后在冰浴条件下，缓慢加入50mmol的硼氢化钠，之后将圆底烧瓶密封，并在封口处扎一个气球，之后再常温条件下搅拌5小时，旋掉多余的无水甲醇溶液，得到中间体Ⅲ(9.02mmol粗品)。

将9.02mmol中间体Ⅲ和浓度为37％的27mmol的甲醛水溶液加入到100ml无水甲醇中，然后在冰浴条件下，缓慢加入40mmol的硼氢化钠，之后将圆底烧瓶密封，并在封口处扎一个气球，之后再常温条件下搅拌5小时，旋掉多余的无水甲醇溶液，用硅胶柱纯化(洗脱剂二氯甲烷：甲醇＝80:1)即得到5.68mmol最终产物—粉防己碱简化物。总收率为60％。结构式如下所示：

6,7-dimethoxy-2-methyl-1-(4-(trifluoromethyl)benzyl)-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline(16):

Yellow oil,yield:60％.

实施例2

取一个250ml的圆底烧瓶，将3，4-二甲氧基苯乙胺11mmol、4-硝基苯乙酸11mmol和硼酸0.88mmol依次加入，之后将其溶于120ml的甲苯之中，在150℃回流条件下搅拌反应12小时。之后浓缩除去溶剂，加入30ml的乙酸乙酯对其洗涤2-3次，之后过滤掉洗涤液，得到中间产物Ⅰ(11.05mmol粗品)

将11.05mmol的中间体Ⅰ和33mmol的三氯氧磷加入到120ml的二氯甲烷中得到反应液，将反应液加热到70℃搅拌5小时后冷却，将反应液倒入250ml烧杯中，缓慢加入饱和碳酸氢钠水溶液对其进行淬灭，直至烧杯中气泡不再大量产生，加入30ml二氯甲烷对淬灭后的反应液进行萃取，得到有机相；对有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋去二氯甲烷即得到中间体Ⅱ(10.55mmol粗品)。

取一个250ml圆底烧瓶，将10.55mmol的中间体Ⅱ溶于100ml无水甲醇中，然后在冰浴条件下，缓慢加入50mmol的硼氢化钠，之后将圆底烧瓶密封，并在封口处扎一个气球，之后再常温条件下搅拌5小时，旋掉多余的无水甲醇溶液，得到中间体Ⅲ(9.97mmol粗品)。

将9.97mmol中间体Ⅲ和浓度为37％的27mmol的甲醛水溶液加入到100ml无水甲醇中，然后在冰浴条件下，缓慢加入40mmol的硼氢化钠，之后将圆底烧瓶密封，并在封口处扎一个气球，之后再常温条件下搅拌5小时，旋掉多余的无水甲醇溶液，用硅胶柱纯化(洗脱剂二氯甲烷：甲醇＝80:1)即得到6.68mmol最终产物。总收率为68％。结构式如下所示：

6,7-dimethoxy-2-methyl-1-(4-nitrobenzyl)-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline:

Yellow oil,yield:68％.

实施例3

取一个250ml的圆底烧瓶，将3，4-二甲氧基苯乙胺27mmol、3-羟基-4-甲氧基苯乙酸27mmol和硼酸2.1mmol依次加入，之后将其溶于150ml的甲苯之中，在150℃回流条件下搅拌反应12小时。之后浓缩除去溶剂，加入60ml的乙酸乙酯对其洗涤2-3次，之后过滤掉洗涤液，得到中间产物Ⅰ(27mmol粗品)

将27mmol中间体Ⅰ与54mmol碳酸钾溶于150ml乙腈中，之后加入28mmol苄溴溶液，在85℃回流条件下，搅拌8小时，待溶液冷却后旋干溶剂，加入60ml二氯甲烷进行萃取，得到有机相；对有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋去二氯甲烷即得到中间体Ⅱ(27mmol粗品)。

将27mmol的中间体Ⅱ和81mmol的三氯氧磷加入到150ml的二氯甲烷中得到反应液，将反应液加热到70℃搅拌5小时后冷却，将反应液倒入250ml烧杯中，缓慢加入饱和碳酸氢钠水溶液对其进行淬灭，直至烧杯中气泡不在大量产生，加入60ml二氯甲烷对淬灭后的反应液进行萃取，得到有机相；对有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋去二氯甲烷即得到中间体Ⅲ(27mmol粗品)。

取一个250ml圆底烧瓶，将7.35mmol的中间体Ⅲ溶于100ml无水甲醇中，然后在冰浴条件下，缓慢加入38mmol的硼氢化钠，之后将圆底烧瓶密封，并在封口处扎一个气球，之后再常温条件下搅拌5小时，旋掉多余的无水甲醇溶液，得到中间体Ⅳ(7.0mmol粗品)。

将0.2mmol中间体Ⅳ、0.2mmol苄溴溶液和0.4mmol碳酸铯加入到50ml乙腈中，之后再8 5℃回流反应条件下搅拌8小时，待冷却后过滤掉未反应完的固体，旋干浓缩溶液，用硅胶柱纯化(洗脱剂二氯甲烷：甲醇＝80:1)即得到27.1mg最终产物。总收率为60％。结构式如下所示：

2-benzyl-1-(3-(benzyloxy)-4-methoxybenzyl)-6,7-dimethoxy-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline:

Pale yellow solid,yield:60％.

实施例4

该实例是基于在本发明的研究方法下所得到药用价值较大的一种特异性P-gp抑制剂，本研究基于分子动力学模拟和碎片生长对天然粉防己碱(TET)进行了合理的结构简化，得到了一个易于制备、具有高逆转活性和低细胞毒性的新型简化化合物OY-101。通过逆转活性测定、流式细胞术、平板克隆形成测定和药物协同分析得到证实其与长春新碱(VCR)对耐药细胞Eca109/VCR的优异协同抗癌作用(IC

取一个250ml的圆底烧瓶，将3，4-二甲氧基苯乙胺27mmol、3-羟基-4-甲氧基苯乙酸27mmol和硼酸2.1mmol依次加入，之后将其溶于150ml的甲苯之中，在150℃回流条件下搅拌反应12小时。之后浓缩除去溶剂，加入60ml的乙酸乙酯对其洗涤2-3次，之后过滤掉洗涤液，得到中间产物Ⅰ(26.5mmol粗品)

将26.5mmol中间体Ⅰ与53mmol碳酸钾溶于150ml乙腈中，之后加入28mmol苄溴溶液，在85℃回流条件下，搅拌8小时，待溶液冷却后旋干溶剂，加入60ml二氯甲烷进行萃取，得到有机相；对有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋去二氯甲烷即得到中间体Ⅱ(26.0mmol粗品)。

将26.0mmol的中间体Ⅱ和78mmol的三氯氧磷加入到150ml的二氯甲烷中得到反应液，将反应液加热到70℃搅拌5小时后冷却，将反应液倒入250ml烧杯中，缓慢加入饱和碳酸氢钠水溶液对其进行淬灭，直至烧杯中气泡不在大量产生，加入60ml二氯甲烷对淬灭后的反应液进行萃取，得到有机相；对有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋去二氯甲烷即得到中间体Ⅲ(25.0mmol粗品)。

取一个250ml圆底烧瓶，将7.35mmol的中间体Ⅲ溶于100ml无水甲醇中，然后在冰浴条件下，缓慢加入38mmol的硼氢化钠，之后将圆底烧瓶密封，并在封口处扎一个气球，之后再常温条件下搅拌5小时，旋掉多余的无水甲醇溶液，得到中间体Ⅳ(7.0mmol粗品)。

将2mmol中间体Ⅳ和浓度为37％的6mmol的甲醛水溶液加入到50ml无水甲醇中，然后在冰浴条件下，缓慢加入6mmol的硼氢化钠，之后将圆底烧瓶密封，并在封口处扎一个气球，之后再常温条件下搅拌5小时，旋掉多余的无水甲醇溶液，用硅胶柱纯化(洗脱剂二氯甲烷：甲醇＝80:1)即得到1.61mmol最终产物。总收率为75％。结构式如下所示：

1-(3-(benzyloxy)-4-methoxybenzyl)-6,7-dimethoxy-2-methyl-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline(OY-101):

Pale yellow solid,yield:75％.

采用本发明所述方法可以得到立体异构体的结构式为：

1-(4-bromobenzyl)-6,7-dimethoxy-2-methyl-1,2,3,4-

tetrahydroisoquinoline，其立体异构体HPLC色谱图参见图20。

实施例5OY-101的生物活性测试部分：

1.对与OY-101的细胞毒性和水溶性的实验

OY-101与阳性药物维拉帕米(VRP)一样，对人食管癌细胞Eca109和耐药细胞Eca109/VCR的细胞毒性较低，其IC

不仅如此，与原药TET相比，简化物OY-101的水溶性得到了显著提高(图2)。

2.对于OY-101对逆转VCR(长春新碱)耐药的实验

在这项研究中，另一个比毒性和水溶性更重要的指标是对化疗药物的逆转活性。为此，我们进行了一系列验证实验以证实OY-101对逆转VCR耐药的作用。

申请人在检测不同浓度受试化合物存在下，VCR对耐药细胞株Eca109/VCR的IC

粉防己碱简化物OY-101联用VCR能显著诱导乳腺癌细胞的凋亡，参见图17；粉防己碱简化物OY-101联用VCR能显著诱导胃癌细胞的凋亡诱导效果，参见图18；粉防己碱简化物OY-101联用VCR能显著诱导肺癌细胞的凋亡诱导效果，参见图19。

不仅如此，新型粉防己碱简化物OY-101与VCR联合用药可显著诱导Eca109/VCR细胞凋亡，流式细胞仪检测不同浓度的OY-101与VCR联用对Eca109/VCR细胞凋亡的影响。如图4所示，5μMDMSO、1μM OY-101、2.5μM OY-101、5μM OY-101、5μM TET、5μMVRP和100nMVCR对Eca109/VCR细胞没有显著毒性。然而，一旦实施联合给药，OY-101、TET和VRP显著提高了VCR对Eca109/VCR的细胞毒性。三次重复实验的结果如图5所示，OY-101的逆转活性最好。

并且OY-101与VCR联合用药能显著抑制Eca109/VCR的克隆形成，平板克隆形成实验也证实OY-101能有效逆转VCR对Eca109/VCR的耐药性。如图6所示，2μM OY-101与40nMVCR的共同给药几乎完全抑制了耐药细胞Eca109/VCR的克隆生长。

3.对于OY-101特异性抑制P-gp外排功能的实验

本发明在确认OY-101能够高效逆转Eca109/VCR的耐药性之后，对相关机制做了探索。首先研究了OY-101对P-gp表达的影响，通过western blotting检测了主要耐药相关蛋白ABCG2、P-gp和MRP1在亲代细胞Eca109和耐药细胞Eca109/VCR中的表达，以及2.5μM、5μM和10μMOY-101对上述蛋白表达的影响。结果显示，耐药细胞Eca109/VCR中P-gp的量显著高于亲代细胞Eca109，而两种细胞系之间的ABCG2和MRP1蛋白的差异不显著，并且OY-101对以上蛋白的表达量并没有影响(图7)。

为了更直接地验证OY-101对P-gp外排功能的抑制作用，使用激光共聚焦显微镜观察OY-101在3小时内对P-gp底物在细胞内积聚的作用。在OY-101处理的耐药细胞Eca109/VCR中清楚地观察到罗丹明123(RH123)和多柔比星(DOX)的细胞内积累的剂量依赖性增加。OY-101处理的荧光强度增幅显著高于TET和VRP处理。除了观察到细胞内荧光强度增加，我们还观察到DOX与细胞核的共定位增加，这意味着DOX对细胞核的毒性增加(图8)。

申请人进一步研究P-gp特异性底物RH123的胞内积累情况，结果显示OY-101能以浓度和时间依赖的方式增加RH123的细胞内荧光强度，并最终趋于饱和(图9)。

本发明还考察了四种不同的荧光底物在OY-101处理后的胞内积累情况(图10)。RH123是P-gp的特异性底物。Calcein-AM也是P-gp的底物，本身没有荧光。进入细胞后，被内源性酯酶水解生成极性Calcein，是MRP1的底物，具有很强的绿色荧光。DOX可以由P-gp和MRP1介导外排。H33342可由ABCG2和MRP1介导外排。因此，考虑到OY-101按RH123、Calcein-AM、DOX和H33342的顺序影响四种荧光底物的细胞内积累，因此我们认为OY-101是一种高效且特异性的P-gp抑制剂(图11)。

为了进一步验证上述推测，通过流式细胞仪测定了测试化合物和荧光底物共孵育后的细胞内荧光强度(图12)。重复三次后，以DMSO组为对照，作出相对平均细胞内荧光强度统计图(图13)。观察到相同的结果:1)OY-101对RH123细胞内积累影响最显著，其次是Calcein-AM。2)OY-101与第三代P-gp抑制剂TQ作用相似，均可显著增加RH123和Calcein-AM的细胞内积累，且均优于TET和VRP。3)耐药细胞Eca109/VCR中荧光底物的积累低于亲代细胞Eca109。

之后，本发明用细胞热转移分析(CETSA)以证实OY-101与P-gp的直接结合亲和力。Eca109/VCR细胞裂解液分别与OY-101、DMSO(阴性对照)和第三代P-gp抑制剂TQ(阳性对照)孵育。然后，随着溶液温度的持续升高，未结合的蛋白质在升高的温度下变性并沉淀，而与化合物结合的蛋白质保留在溶液中。如图14所示，OY-101和TQ显著稳定P-gp蛋白，尤其是在高温(67℃)下，而溶剂对照组中的P-gp蛋白在此温度下显著降解。结果表明，OY-101与第三代抑制剂TQ一样，能直接与P-gp结合并稳定P-gp。

申请人确定了OY-101对某些化疗药物的逆转活性，这些化疗药物通常由ABC外排泵输送。在与5μM OY-101共同给药的情况下，测定了不同抗肿瘤药物对亲代细胞Eca109和耐药细胞Eca109/VCR的IC

4.将OY-101用于动物的实验

在裸鼠中建立了携带P-gp过表达的Eca109/VCR细胞的异种移植瘤模型，以检测OY-101在体内的逆转活性。用溶剂对照(10毫升/公斤/2天，静脉注射)、VCR(0.2毫克/公斤/2天，静脉注射)、OY-101(30毫克/公斤/2天，静脉注射)和OY-101/VCR组合治疗裸鼠。如图16所示，只有OY-101与VCR共同给药才能有效抑制体内肿瘤增殖(P<0.001)，并显著降低肿瘤重量。治疗3周后，OY-101/VCR组合的肿瘤生长抑制率为79.13％，明显低于单一治疗组和溶剂对照组(图16A-C)。在试验剂量的治疗期间，各组的体重没有显著变化(图16D)。肿瘤的病理学和TUNEL分析显示，治疗，特别是OY-101/VCR组合，增加了肿瘤组织中细胞核固缩、空泡和凋亡的细胞比例。HE染色分析显示，OY-101与VCR联合给药不会增加肝毒性(图16E)。这些结果表明OY-101是一种有效的P-gp抑制剂，可以逆转VCR耐药性并抑制Eca109/VCR异种移植物中的肿瘤生长，且毒性低。

结论：

本发明涉及一类新型粉防己碱简化物。经过计算机辅助药物设计及合理结构简化，我们发现一类新型粉防己碱简化物能够特异性抑制P-gp、高效逆转肿瘤细胞多药耐药。其中以OY-101为代表的简化物，在体内外均表现出及其优异的逆转活性，。重要的是，OY-101可以通过5步反应以75％的总收率高效合成，并且具有较低的细胞毒性和良好的水溶性。进一步的机理研究证实OY-101是一种特异且高效的P-gp抑制剂。在体内外均可有效抑制耐药肿瘤的生长。因此，OY-101由于其低细胞毒性、简单的可合成性、良好的水溶性以及优异的耐药肿瘤逆转活性，具有进一步开发成耐药肿瘤增敏剂的应用潜力。