一株肺炎克雷伯氏菌及其在降解菲中的应用

摘要

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株肺炎克雷伯氏菌及其在降解菲中的应用。本发明提供的一株肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)DS‑1，保藏编号为CCTCCNO:M2023703。本发明提供的肺炎克雷伯菌DS‑1基因组中含有降解菲的基因pcaC、pcaD、pcaG、pcaH、catA、catB、catC、benA、benB、benC、benD、fadA和fadl，通过邻苯二甲酸途径能够实现菲的降解，产生1‑羟基‑2‑萘甲酸，1‑羟基‑2‑萘甲醛以及原儿茶酸等降解中间体。可见，本发明的肺炎克雷伯菌DS‑1在菲生物降解中具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株肺炎克雷伯氏菌及其在降解菲中的应用。

背景技术

多环芳烃(PAHs)是环境中广泛存在的持久性有机化合物，即使在北极地区，它们也是稳定存在的。煤和石油的不完全燃烧会产生大量的PAHs。PAHs随着废水的排放，对水环境造成污染。PAHs还可能通过多种途径摄入人体。长期暴露于PAHs环境下会诱发多种人体产生多种不良健康效应，患多种疾病如癌症。

菲(Phenanthrene，PHE)是致癌性PAHs的最小特征单元，具有海湾、Bay分子区域、K分子区域。此外，在水环境中已经发现的PAHs中，菲占有最大的比例。因此，PHE的生物去除是该领域的主要目标。

在世界范围内，利用不同微生物降解污染区的PHE受到越来越多的关注。与吸附、光解、挥发和化学降解等传统的PAHs降解方法相比，生物降解法具有成本效益高、二次污染风险低等优点。现有技术中已经报道了PAH生物降解中应用的多种微生物，如分枝杆菌(Mycobacterium sp.)、新鞘氨醇杆菌、热带根瘤菌、假单胞菌(Pseudomonas sp.)和伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)等。

作为分解者，上述这些细菌偏好以低环PAHs作为碳源，利用环状烃基加氧酶降解低环PAHs。环状烃基加氧酶是由nah-like(nahR和nahAc)和其他不同基因(phd、nid、nag、phn和nar)编码的双加氧酶。

PAHs被环状烃基加氧酶降解后被脱氢酶分解形成二羟基化中间产物，最终经过循环裂解形成三羧酸(TCA)循环的中间产物。分离得到上述微生物能够在7天内降解50mg/L的PAHs。

因此，引入具有优良降解能力的PAH降解菌进行生物强化具有重要意义，但是菲的生物降解效果不佳。

发明内容

本发明的目的提供一株肺炎克雷伯氏菌及其在降解菲中的应用，本发明提供的肺炎克雷伯菌DS-1为菲污染环境中的高效降解菌，能够降解菲。

为了解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一株肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)DS-1，保藏编号为CCTCC NO:M 2023703。

本发明提供了一种含有上述技术方案所述的肺炎克雷伯菌DS-1的菌剂。

本发明提供了上述技术方案所述的肺炎克雷伯菌DS-1或上述技术方案所述的菌剂在以下1)和/或2)中的应用：

1)降解菲和/或邻苯二甲酸；

2)提高菲和/或邻苯二甲酸的降解率。

优选的，所述菌剂包括菌液，所述菌液的OD

优选的，所述降解的温度为25～37℃。

优选的，所述降解的pH值为6～9。

本发明提供了一种降解菲的方法，包括以下步骤：将上述技术方案所述的肺炎克雷伯菌DS-1和含有菲的待降解物混合，进行降解。

优选的，所述降解的温度为25～37℃。

优选的，所述含有菲的待降解物的pH值为6～9。

优选的，所述含有菲的待降解物中菲的质量浓度＜200mg/L。

本发明的有益效果：本发明提供一株肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)DS-1，保藏编号为CCTCC NO:M 2023703，本发明提供的雷白氏菌DS-1的基因组中含有降解菲的基因pcaC、pcaD、pcaG、pcaH、catA、catB、catC、benA、benB、benC、benD、fadA和fadl，通过邻苯二甲酸途径实现菲的降解，产生1-羟基-2-萘甲酸，1-羟基-2-萘甲醛以及原儿茶酸等降解中间体。可见，本发明的肺炎克雷伯菌DS-1在菲生物降解中具有良好的应用前景。

生物保藏说明

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)DS-1，于2023年05月08日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2023703，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例1肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)DS-1的电镜扫描图(500nm)；

图2为实施例1肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)DS-1的电镜扫描图(1μm)；

图3为实施例1肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)DS-1的16S rDNA序列与NCBI 16S数据库的比对图；

图4为实施例1构建的肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)DS-1菌株的系统发育树图；

图5为实施例2的DS-1菌株不同培养时间下的锥形瓶中菲的含量和培养液吸光值图；

图6为实施例3-1～3-3和对比例3-1的DS-1菌株不同培养温度下的锥形瓶中菲的含量；

图7为实施例4-1～4-3和对比例4-1的DS-1菌株不同菲的初始质量浓度下的锥形瓶中菲的含量；

图8为实施例5-1～5-4和对比例5-1的不同培养pH值下的锥形瓶中菲的含量；

图9为注释到菌株DS-1的降解菲的基因信息图。

具体实施方式

本发明提供了一株肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)DS-1，保藏编号为CCTCC NO:M 2023703。本发明所述肺炎克雷伯菌DS-1的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

环境因子改变了PAHs降解菌的活性和降解能力，导致产生不同的生物强化效果。本发明利用从污染场地中筛选的具有降解能力的功能微生物来加速和改善这些地区的生物修复。本发明从污水处理厂的污水中分离得到一株能够降解菲的菌株DS-1，为促进生化池中PAHs的降解提供选择高效降解菌。

本发明所述肺炎克雷伯菌DS-1从吉林石化污水厂采集的活性污泥样品中分离得到，具备良好的环境适应性。肺炎克雷伯菌DS-1含有降解菲的基因pcaG、pcaH、fatD、catA和catB，通过邻苯二甲酸途径实现菲的降解。本发明所述肺炎克雷伯菌DS-1菌落形态外观呈现白色，圆形，边缘整齐，表面光滑。DS-1显微镜下呈杆状，菌株大小为0.5～0.8×1.0～1.2μm。

本发明利用DS-1的16S rDNA序列与NCBI 16S数据库中的数据进行比对，初步确定菌株的分类信息，构建DS-1菌株的系统发育树，鉴定结果表明菌株DS-1为克雷伯氏菌属肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)菌株。

本发明提供了一种含有上述技术方案所述的肺炎克雷伯菌DS-1的菌剂。本发明对所述菌剂的制备方法优选包括如下步骤：将所述肺炎克雷伯菌DS-1接种于LB液体培养基中进行培养，得到菌剂。本发明所述培养的温度优选为25～30℃，进一步优选为28～30℃，更优选为30℃。本发明所述培养的时间优选为8～16h，进一步优选为9～13h，更优选为10～12h。本发明所述接种的参数没有特殊限定，采用常规的方法即可。本发明所述LB液体培养基优选以水为溶剂，包括以下浓度组分：9.8～10g/L胰蛋白胨、4.8～5g/L酵母粉和9.8～10g/L氯化钠，更优选为10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L氯化钠。

在本发明中，所述菌剂优选包括菌液，所述菌液的OD

本发明提供了上述技术方案所述的肺炎克雷伯菌DS-1或上述技术方案所述的菌剂在以下1)和/或2)中的应用：

1)降解菲和/或邻苯二甲酸；

2)提高菲和/或邻苯二甲酸的降解率。

在本发明中，所述应用优选包括：将上述技术方案所述的肺炎克雷伯菌DS-1或上述技术方案所述的菌剂施用于含有菲的待降解物中降解菲。

本发明提供了一种降解菲的方法，包括以下步骤：将上述技术方案所述的肺炎克雷伯菌DS-1和含有菲的待降解物混合，进行降解。

在本发明中，所述混合的方法没有特殊限定，采用常规的方法即可。

在本发明中，所述含有菲的待降解物优选包括含有菲的无机矿物盐培养基。

本发明所述无机矿物盐培养基优选以水为溶剂，优选的包括以下浓度的组分：4～4.5g/L Na

在本发明中，所述降解温度优选为25～37℃，进一步优选为29～32℃，更优选为30℃。本发明所述降解的时间优选为8～12d，进一步优选为9～11d，更优选为9d或10d。

在本发明中，所述含有菲的待降解物的pH值优选为6～9，进一步优选为6.3～7.5，更优选为7。在本发明中，所述含有菲的待降解物中的菲质量浓度优选为小于200mg/L，进一步优选为≤100mg/L，再进一步优选为20～50mg/L，更优选为20mg/L。

当含有菲的待降解物中的菲的质量浓度为100mg/L时，DS-1菌株在10d的时间内共降解的菲的浓度为80.4mg/L，菲降解率为80.4％。当含有菲的待降解物中的菲的质量浓度为20mg/L时，DS-1菌株在9d的时间内共降解的菲的浓度为17.68mg/L，菲降解率为88.4％。

当含有菲的待降解物中的菲的质量浓度为50mg/L时，DS-1菌株在9d的时间内共降解的菲的浓度为26.96mg/L，菲降解率为53.92％。

当含有菲的待降解物中的菲的质量浓度为100mg/L时，DS-1菌株在9d的时间内共降解的菲的浓度为79.18mg/L，菲降解率为79.18％。

本发明所述温度、pH值、菲在无机矿物盐培养基中的初始质量浓度的设定在于提高肺炎克雷伯菌DS-1的菲降解率。菌株DS-1在温度为30℃、pH值为7、菲的初始质量浓度为20mg/L时，菲的最大的降解率为84.5％。通过液相色谱三重四级杆质谱联用仪对菌株DS-1降解产物进行分析，检测出了邻苯二甲酸途径中的邻苯二甲酸，1-羟基-2-萘甲酸，1-羟基-2-萘甲醛以及原儿茶酸等降解中间体的存在，推断菌株DS-1降解菲的途径为邻苯二甲酸途径。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1菌株DS-1的富集与筛选

1.培养基

(1)无机矿物盐培养基(MSM)组成及制备方法：称取4.26g的Na

(2)无机矿物盐固体培养基组成及制备方法：称取4.26g的Na

(3)LB液体培养基(即富集培养基)组成及制备方法：称取10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10g的氯化钠，溶解后定溶于1000mL的容量瓶中，得到LB液体培养基。LB液体培养基高压蒸汽灭菌后应用。

2.菌株DS-1的富集与筛选

(1)驯化。取在吉林石化污水厂采集的活性污泥放置于50mL的离心管中，随后将离心管在4000r/min的转速下离心3min，得上清液。取10mL上清液加入含有底物菲的无机盐矿物培养基中，放置于30℃培养箱中避光震荡培养。所述无机盐矿物培养基中菲的质量浓度为100mg·L

(2)富集培养。取驯化所得培养基按照体积比10％的接种量转接至具有相同培养体系的新鲜富集培养基中在温度为30℃条件下培养7d，完成第一次富集，得到第一代富集样品；并重复上述富集过程，直至重复三次，得到的第四代富集样品。

(3)菌株筛选。用稀释平板法对上述步骤(2)获得的第四代富集样品进行涂布分离，涂布分离应用的培养基为无机矿物盐固体培养基。

第四代富集样品先进行梯度稀释至10

若经过划线纯化的平板上仍能生长出不同类型的单菌落，挑出单菌落并再次进行划线纯化，直至在同一平板上不能观察到不同特征的单菌落为止。筛选纯化后得到一株菌株。该菌株在平板上涂布后为白色、圆形、边缘整齐、表面光滑的菌落。菌株被命名为DS-1。

挑取纯化后的菌株DS-1单菌落到LB液体培养基中培养至对数期，培养温度为30℃，培养时间为10h，得到菌液。将培养所得菌液和无菌甘油混合分装至2mL冻存管中，甘油和水按照体积比1:1配置成浓度为50％的甘油，50％甘油再和菌液等体积混合保存，放置于-80℃冰箱长期保存。

3.菌株的扫描电镜观察

(1)步骤2筛选所得菌株DS-1在富集培养基中振荡富集培养24h；

(2)取富集培养所得的菌液，在转速为4000r/min条件下离心10min，弃去上清液；

(3)向离心所得DS-1菌体中加入质量浓度为2.5％戊二醛溶液并在4℃条件下浸泡过夜；

(4)弃掉固定液，用摩尔浓度为1mol·L

(5)步骤(4)离心所得DS-1菌体依次用体积浓度为30％、50％、70％和90％的乙醇溶液进行脱水处理，每次15～30min，再用体积浓度为100％乙醇溶液脱水处理两次，再在转速为3000r/min的条件下离心分离，得到DS-1菌体沉淀；

(6)步骤(5)所得DS-1菌体沉淀用叔丁醇置换30min，冷冻干燥；

(7)步骤(6)冷冻干燥所得物固定、喷金，置于扫面电镜下观察和拍照，见图1(500nm)和图2(1μm)。根据图1和图2可知，该菌株DS-1呈短杆状，菌株大小为0.5～0.8×1.0～1.2μm。

4.16S rDNA序列的测定

步骤2得到的DS-1菌株纯化后提取基因组DNA，以所得基因组DNA为模版，以27F(SEQ ID NO：2序列：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(SEQ ID NO：3序列：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3')作为引物进行PCR扩增，PCR扩增反应体系见表1-1，PCR扩增反应程序：预变性95℃，5min；变性95℃，30s；退火58℃，30s；延伸72℃，1min30s；终延伸72℃，7min；循环数35。

表1-1 PCR扩增反应体系

PCR扩增后，取得到的PCR产物，取3μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。确认PCR扩增片段。PCR产物用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收，纯化后的PCR产物使用测序仪ABI3730-XL进行DNA测序。用NCBI Blast程序将拼接后的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。16S rDNA序列文件与NCBI16S数据库中的数据进行比对，初步确定菌株的分类信息(见图3)，构建DS-1菌株的系统发育树(见图4)。根据图3和图4可知利用16S rDNA鉴定表明DS-1菌株为肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)菌株。

SEQ ID NO：1序列：CTCCCGAAGGTTAAGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTAGCATTCTGATCTACGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACATACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGAGGTCGCTTCTCTTTGTATATGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCAGTTTATCACTGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGGCCGGACCGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCACAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTGTGGATGTCAAGACCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGATTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACGCCTCAAGGGCACAACCTCCAAATCGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGTCAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACAAGACTCTAGCCTGCCAGTTTCGAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACATCCGACTTGACAGACCGCCTGCGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCGGGTAACGTCAATCGCCAAGGTTATTAACCTTAACGCCTTCCTCCCCGCTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCTGGTCATCCTCTCAGACCAGCTAGGGATCGTCGCCTAGGTGAGCCGTTACCCCACCTACTAGCTAATCCCATCTGGGCACATCTGATGGCATGAGGCCCGAAGGTCCCCCACTTTGGTCTTGCGACATTATGCGGTATTAGCTACCGTTTCCAGTAGTTATCCCCCTCCATCAGGCAGTTTCCCAGACATTACTCACCCGTCCGCCGCTCGTCACCCGAGAGCAAGCTCTCTGTGCTACCGCTCGACTTGCATGTGTTAGGCCTGCCGCCAGCGTTCAATCTGAGCCAGTTCAAAACTAT。

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)DS-1保藏编号为CCTCC M 2023703。

实施例2菌株DS-1降解菲的能力及其菌株的生长

将实施例1筛选出的DS-1菌株置于温度为30℃，pH值为7的含有100mg/L的菲的无机矿物盐培养基中，在150rpm的转速下进行培养。培养周期为10d，每隔1d取出培养所得物样品，利用HPLC检测锥形瓶中菲的含量，从而确定其降解率。同时利用移液枪移取200μL于96孔板板中，利用酶标仪测定培养液在波长入＝600nm处的吸光值(OD值)。结果见图5和表1-2。

降解率＝(初始浓度-剩余浓度)/初始浓度×100％

表1-2不同培养时间下的锥形瓶中菲的含量和培养液吸光值

根据图5和表1-2可知，DS-1菌株在10d的时间内共降解的菲的浓度为80.4mg/L，菲降解率为80.4％。由于在菲降解初期DS-1菌株处于生长适应阶段，因此在降解的第0～1d菲降解速率相对缓慢。在DS-1菌株降解菲第2d晚上培养液出现了浑浊现象。从菲降解第2d开始DS-1菌株进入到了对数增长期，因此在菲降解第2d至第5d的时间里菲降解率逐渐提高，锥形瓶中菲的剩余含量大幅度降低。从菲降解第5d开始，菲降解率逐渐降低，锥形瓶中培养液DS-1菌株的OD

实施例3-1

将实施例1筛选出的DS-1菌株制备成菌液，菌液的OD

从摇床中取出培养第1d、3d、5d、7d、9d的所得培养物，向其中加入等体积的乙腈，旋涡震荡1min，使得菲充分溶解，使用注射器吸取液体，并通过0.22μm的滤膜过滤后，加入到液相进样瓶中，利用高效液相色谱法测定锥形瓶中菲的剩余含量，计算菲的降解率。设置3个平行实验。

实施例3-2

同实施例3-1，唯一的区别在于培养温度为25℃。

实施例3-3

同实施例3-1，唯一的区别在于培养温度为37℃。

对比例3-1

同实施例3-1，唯一的区别在于培养温度为20℃。

采用高效液相色谱法测定实施例3-1～3-3和对比例3-1的锥形瓶中菲的剩余含量，计算菲的降解率。

高效液相色谱法具体参数：使用岛津LC-20AP高效液相色谱仪对待测样品进行检测，将甲醇与水的体积比调整为90％：10％，并在使用前超声处理20min，以排尽流动相的气泡。柱温箱设置为35℃，色谱柱的流速调整为0.8mL/min，紫外检测器检测波长调节为254nm。开机后，首先使用流动相冲洗色谱柱，持续约30min后，开始检测样品，进样体积为10μL。

实施例3-1～3-3和对比例3-1的测定结果见表2和图6。

表2不同培养温度下的锥形瓶中菲的含量和培养液吸光值

温度是微生物生长的关键因素，它不仅会影响微生物的形态和功能，还会对降解菲的效率产生重要影响。根据表2和图6可知，在降解第一天时温度为20℃、25℃、30℃、37℃下菌株DS-1的菲降解率相差不大，但是降解第9d以后，温度为30℃下DS-1菌株对于菲的降解率为79.2％，远远高于在其他温度下对菲的降解率。该研究表明，温度为30℃最适合菌株的DS-1的生长，促进菲的降解。当温度为20℃时，菲的降解率最低，这可能是由于低温条件下抑制了降解菲所需要的酶的活性导致。

实施例4-1

将实施例1筛选出的DS-1菌株制备成菌液，菌液的OD

从摇床中取出培养第1d、3d、5d、7d、9d的所得培养物，向其中加入等体积的乙腈，旋涡震荡1min，使得菲充分溶解，使用注射器吸取液体，并通过0.22μm的滤膜过滤后，加入到液相进样瓶中，利用高效液相色谱法测定锥形瓶中菲的剩余含量，计算菲的降解率。设置3个平行实验。

实施例4-2

同实施例4-1，唯一的区别在于无机矿物盐培养基中菲的初始质量浓度为50mg/L。

实施例4-3

同实施例4-1，唯一的区别在于无机矿物盐培养基中菲的初始质量浓度为100mg/L。

对比例4-1

同实施例4-1，唯一的区别在于无机矿物盐培养基中菲的初始质量浓度为200mg/L。

采用高效液相色谱法测定实施例4-1～4-3和对比例4-1的锥形瓶中菲的剩余含量，计算菲的降解率。

高效液相色谱法具体参数同实施例3-1。实施例4-1～4-3和对比例4-1的测定结果见表3和图7。

表3不同菲的初始质量浓度下的锥形瓶中菲的含量和培养液吸光值

根据表3和图7可知，菌株DS-1对不同浓度的菲的降解率表现出了明显的差异。菌株DS-1在不同浓度20mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L菲的培养基中都完成了对菲降解。在降解第1d时，菌株DS-1在不同的浓度下的降解率几乎相同。从降解第2d开始，菌株DS-1的降解率开始提高。在培养天数达到9d时，当菲的浓度为20mg/L时菌株DS-1对其降解率达到了88.4％，明显高于其它浓度下菌株DS-1对菲的降解率，表明菲的浓度为20mg/L时，达到了该菌株DS-1的最大降解能力。当菲的浓度增加时，降解率呈现下降趋势，但没有完全起到抑制作用。当浓度提高的到200mg/L时，菲的降解率明显降低，仅仅只有25.8％。一方面，产生此现象的原因可能是因为培养基中菲的浓度过高，包裹在微生物的表面影响了DS-1菌株吸收其它的营养物质。另一方面可能因为随着培养基中菲浓度的升高，毒性也随之升高，抑制菌株对于菲的降解。

实施例5-1

将实施例1筛选出的DS-1菌株制备成菌液接种无机矿物盐培养基中进行摇床培养，菌液的OD

从摇床中取出培养第1d、3d、5d、7d、9d的所得培养物，向其中加入等体积的乙腈，旋涡震荡1min，使得菲充分溶解，使用注射器吸取液体，并通过0.22μm的滤膜过滤后，加入到液相进样瓶中，利用高效液相色谱法测定锥形瓶中菲的剩余含量，计算菲的降解率。设置3个平行实验。

实施例5-2

同实施例5-1，唯一的区别在于无机矿物盐培养基加入菲后的初始pH值为6.0。

实施例5-3

同实施例5-1，唯一的区别在于无机矿物盐培养基加入菲后的初始pH值为8.0。

实施例5-4

同实施例5-1，唯一的区别在于无机矿物盐培养基加入菲后的初始pH值为9.0。

对比例5-1

同实施例5-1，唯一的区别在于无机矿物盐培养基加入菲后的初始pH值为5.0。

采用高效液相色谱法测定实施例5-1～5-4和对比例5-1的锥形瓶中菲的剩余含量，计算菲的降解率。

高效液相色谱法具体参数同实施例3-1。实施例5-1～5-4和对比例5-1的测定结果见表4和图8。

表4不同培养pH值下的锥形瓶中菲的含量和培养液吸光值

无机矿物盐培养基环境中的pH影响菲的降解率。根据表4和图8可知，培养第1天时不同pH值条件下菲的降解率几乎相同。培养3d后，实施例5-1～5-4、对比例5-1的菲降解率出现了显著的差别，pH值为7.0时菌株DS-1对菲的降解率最高，达到30.4％。培养9d后，依旧出现此现象，菌株DS-1对菲的降解率达到了79.2％，为最高的降解率。该研究表明培养基的pH为7.0时为该菌株DS-1的最适pH，对菲有最优的降解效果。当pH值为6.0、8.0、9.0时，DS-1具有相近的降解率，降解率都在65％左右，表明该菌株具有一定的环境适应能力，可以在不同的pH值条件下对菲进行降解，但该菌株不适合在酸性条件下进行降解。

实施例6

通过委托上海派森诺生物科技有限公司对菌株DS-1的基因组进行分析，筛选出了降解菲的基因pcaC、pcaD、pcaG、pcaH、catA、catB、catC、benA、benB、benC、benD、fadA和fadl(见图9)以及对其功能进行了预测。通过液相色谱三重四级杆质谱联用仪对其降解产物进行分析，检测出了邻苯二甲酸途径中的邻苯二甲酸，1-羟基-2-萘甲酸，1-羟基-2-萘甲醛以及原儿茶酸等降解中间体的存在。综合两部分结果推断菌株DS-1降解菲的途径为邻苯二甲酸途径。

综上，本发明了提供一株肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)菌株，该菌株被命名为DS-1。菌株DS-1能降解菲，菌株DS-1在不同的pH值(5～9)、温度(20～37℃)、菲初始浓度(20～200mg/L)的条件下均可以降解菲。菌株DS-1的最佳生长条件为温度30℃、pH值为7。当菲初始浓度为20mg/L时，产生了最大的菲降解率为84.5％。菌株DS-1降解菲的途径为邻苯二甲酸途径。可见，本发明的肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)菌株DS-1在菲降解方面具有良好的应用前景。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。