一种提高黄瓜耐热性的外源制剂及其应用

摘要

本发明涉及黄瓜种植技术领域，尤其涉及一种提高黄瓜耐热性的外源制剂及其应用。本发明发现了蔗糖、壳聚糖、γ‑氨基丁酸和氯化钙具备调控黄瓜幼苗耐热性能的作用，其中以蔗糖效果较优，可以有效提高黄瓜幼苗在热胁迫情况下的抗氧化酶活性，降低丙二醛含量以及促进热胁迫相关基因的表达。基于此，本发明提供一种包括蔗糖的外源制剂，其可以有效提高黄瓜幼苗的耐热性能，在黄瓜种植领域具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及黄瓜种植技术领域，尤其涉及一种提高黄瓜耐热性的外源制剂及其应用。

背景技术

黄瓜(cucumis sativus L.)是一种喜温不耐热的作物，白天生长适温为25-30℃，超过35℃的高温便会对其生长造成不利影响。持续的高温条件会导致黄瓜光合能力下降，体内活性氧含量激增，膜脂氧化程度加深等系列问题，进而导致黄瓜坐果率降低、植株长势弱，影响其产量和品质，造成经济效益的损失。

黄瓜耐热性是由多基因控制的数量性状，易受环境影响，有关耐热性遗传规律和遗传模型尚不完善，导致黄瓜耐热品种选育的周期长、效率低。而喷施外源制剂则是植物应对高温胁迫一种见效快、成本低的方法。

现有研究发现，蔗糖不仅作为植物体内重要的能量来源和结构物质，此外还具有信号调节功能；蔗糖可调控转录因子的表达和酶活性来参与植物生长发育和逆境响应。

壳聚糖是几丁质经脱乙酰作用的产物，由于其具备的天然高分子的生物官能性、安全性和微生物降解性等优势，常被医药、食品、化工、生物医学工程等领域广泛研究应用。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种提高黄瓜耐热性的外源制剂及其应用，以蔗糖作为外源制剂可以有效提高黄瓜幼苗的耐热性能。

第一方面，本发明提供蔗糖在调控黄瓜的耐热性能中的应用。

进一步地，所述应用包括如下任意一种或多种：

i)提高黄瓜的抗氧化酶活性；

ii)降低黄瓜的膜脂氧化程度；

iii)降低黄瓜的丙二醛含量；

iv)增加黄瓜的色素含量中的应用。

进一步地，所述热胁迫基因包括：热激转录因子和/或AP2。

进一步地，所述调控黄瓜的耐热性能为提高黄瓜的耐热性能。

进一步地，所述黄瓜为黄瓜幼苗。

第二方面，本发明提供一种提高黄瓜耐热性的外源制剂，包括蔗糖；所述蔗糖的浓度为0.1～5g/L。

进一步地，所述蔗糖的浓度为0.1～2.5g/L。

进一步地，还包括壳聚糖、γ-氨基丁酸或氯化钙中的一种或多种。

进一步地，所述壳聚糖的浓度为0.05～1.5g/L；和/或，所述γ-氨基丁酸的浓度为0.05～1.5g/L；和/或，所述氯化钙的浓度为0.5～2g/L。

作为一种优选的具体实施方式，本发明提供一种外源制剂，包括0.5～2g/L蔗糖+0.1～1g/L壳聚糖。

进一步地，还包括0.1～1％吐温-20。

本发明进一步提供所述外源制剂在提高黄瓜幼苗的耐热性能中的应用。

本发明具有如下有益效果：

本发明发现蔗糖、壳聚糖、γ-氨基丁酸或氯化钙等物质可以提高黄瓜幼苗的耐热性能，在黄瓜幼苗生长期间施加这些物质，可以在热胁迫情况下提高黄瓜的抗氧化酶活性，降低黄瓜的膜脂氧化程度，降低黄瓜的丙二醛含量，增加黄瓜的色素含量，以及促进黄瓜的热胁迫相关蛋白的表达，进而有效提高黄瓜的耐热性能。

本发明所提供的技术方案操作简单，使用方便，叶面喷施后对于提高黄瓜耐热性效果显著，见效快。

本发明所提供的制剂原料来源广、成本低且安全无毒，不会对植物或人体产生安全隐患。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的特定试剂对热胁迫下黄瓜幼苗抗氧化物酶活性的影响示意图(采用邓肯检验法进行差异分析，不同小写字母表示在P<0.05水平下有显著差异，n＝3)。

图2为本发明实施例1提供的特定试剂对热胁迫下黄瓜幼苗丙二醛含量的影响示意图。

图3为本发明实施例1提供的γ-氨基丁酸、壳聚糖、氯化钙和蔗糖对热胁迫下黄瓜幼苗色素含量的影响示意图；其中，A为对叶绿素a含量的影响，B为对叶绿素b含量的影响，C为对类胡萝卜素含量的影响，D为对叶绿素总含量的影响。

图4为本发明实施例1提供的γ-氨基丁酸、壳聚糖、氯化钙和蔗糖对热胁迫下黄瓜幼苗热胁迫相关基因表达的影响示意图；其中A为对HSF相对表达量的影响，B为对HSP20相对表达量的影响，C为对AP2相对表达量的影响。

图5为本发明实施例1提供的不同浓度蔗糖对热胁迫下黄瓜幼苗抗氧化物酶活性的影响示意图；其中，A为对POD活性的影响，B为对CAT活性的影响，C为对SOD活性的影响。

图6为本发明实施例1提供的不同浓度蔗糖对热胁迫下黄瓜幼苗丙二醛含量的影响示意图。

图7为本发明实施例1提供的不同浓度蔗糖对热胁迫下黄瓜幼苗色素含量的影响示意图；其中，A为对叶绿素a含量的影响，B为对叶绿素b含量的影响，C为对类胡萝卜素含量的影响，D为对叶绿素总含量的影响。

图8为本发明实施例1提供的不同浓度蔗糖对热胁迫下黄瓜幼苗热胁迫相关基因表达的影响示意图；其中A为对HSF相对表达量的影响，B为对HSP20相对表达量的影响，C为对AP2相对表达量的影响。

图9为本发明实施例1提供的不同制剂组合对热胁迫下黄瓜幼苗抗氧化物酶活性的影响示意图；其中，A为对POD活性的影响，B为对CAT活性的影响，C为对SOD活性的影响。

图10为本发明实施例1提供的不同试剂组合对热胁迫下黄瓜幼苗丙二醛含量的影响示意图。

图11为本发明实施例1提供的不同试剂组合对热胁迫下黄瓜幼苗色素含量的影响示意图；其中，A为对叶绿素a含量的影响，B为对叶绿素b含量的影响，C为对类胡萝卜素含量的影响，D为对叶绿素总含量的影响。

图12为本发明实施例1提供的不同试剂组合对热胁迫下黄瓜幼苗热胁迫相关基因表达的影响示意图；其中A为对HSF相对表达量的影响，B为对HSP20相对表达量的影响，C为对AP2相对表达量的影响。

图13为本发明实施例1提供的不同试剂组合下黄瓜幼苗的长势情况示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明所用黄瓜材料均为已公开的黄瓜材料，本发明的黄瓜材料新泰密刺及S19096属于发表文章中的R53和R47。该材料已在期刊文章(Liu B,Guan D,Zhai X,etal.Selection footprints reflect genomic changes associated with breedingefforts in 56 cucumber inbred lines[J].Horticulture research 2019,6(127).)中公开。

若未做特别说明，本发明实施例中所用的试剂均可市售购得。

实施例1

1、试验材料：新泰密刺、S19096。

2、试验设计

取长势饱满的黄瓜种子置于恒温培养箱催芽两天，取发芽一致的种子播种于育苗穴盘，基质为草炭和蛭石(草炭：蛭石为2：1)，放置于光照培养箱培养，光照培养箱内生长条件设为白天25℃/12h，光照度30000lux；夜间18℃/12h，光照度0lux；空气相对湿度60％-80％。待幼苗长至两叶一心期，挑选长势一致的幼苗用于热胁迫处理。

热胁迫条件设为白天38℃/9h，光照度30000lux；夜间28℃/15h，光照度0lux；空气相对湿度60％-80％。

2.1单一试剂喷施对热胁迫中黄瓜幼苗的影响

本发明首先选用0.5g/L蔗糖(SUC)、0.1g/L壳聚糖(CTS)、0.1g/Lγ-氨基丁酸(GABA)和1.0g/L氯化钙(CaCl

高温胁迫前一天喷施一次，热胁迫中每天清晨或傍晚喷施一次，喷施至叶片均匀挂湿即可。

热胁迫2h后取黄瓜叶片保存于液氮用于实时荧光定量PCR(qRT-PCR)以检测热胁迫相关基因的表达情况。

热胁迫7天后测定不同处理下黄瓜幼苗叶片的抗氧化物酶活性(超氧化物歧化酶、抗氧化物酶、抗氧化氢酶)、丙二醛含量、光合色素含量(包括叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总含量、类胡萝卜素)；

综合四种试剂喷施下的黄瓜幼苗在以上指标的表现情况，筛选一种最佳制剂并进行后续的浓度筛选。

2.2不同浓度的蔗糖喷施对热胁迫中黄瓜幼苗的影响

蔗糖溶液共设置5个浓度梯度，分别为0.1g/L、0.5g/L、1.0g/L、2.5g/L、5.0g/L；以喷施去离子水为对照组(设为CK)。另选新泰密刺和S19096两个品种同时进行高温处理及后续指标测定，以探究特定试剂喷施对于不同品种黄瓜幼苗耐热性的提高是否具有同样效果。其余步骤(相关检测的步骤)同上。

2.3特定试剂组合喷施对热胁迫中黄瓜幼苗的影响

从不同外源制剂中选择一种或多种试剂与蔗糖进行组合，设置以下实验组，分别为1.0g/L蔗糖(SUC)，1.0g/L蔗糖+0.1g/Lγ-氨基丁酸(SUC+GABA)，1.0g/L蔗糖+0.1g/L壳聚糖(SUC+CTS)，1.0g/L蔗糖+0.1g/Lγ-氨基丁酸+0.1g/L壳聚糖(SUC+GABA+CTS)；以喷施去离子水为对照组(设为CK)。其余同上。

3、指标测定方法

超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑(NBT)法测定，过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法测定，过氧化氢酶(CAT)活性采用紫外分光光度法测定。

丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法(TBA)测定。

叶绿素含量用分光光度法测定，取0.15g去叶脉叶片浸泡在20ml95％乙醇溶液中，黑暗提取36h后摇匀，用Genesys180型号紫外可见光分光光度计测定提取液在665nm、649nm、470nm处的光密度值。

使用华越洋公司提供的快速通用植物RNA提取试剂盒提取黄瓜叶片总RNA。使用TIANGN公司的FastKing一步法除基因组cDNA合成试剂盒将1μg RNA样本反转录为互补DNA(cDNA)。采用QuantStudioTM 6 Flex System进行qRT-PCR。

反应体系如下：5μL SYBR Green Mix，0.5μL cDNA模板，4μLddH

以Ubiqutin作为内参基因，用CT值的2

表1测定基因所用引物列表

4、数据处理

采用SPSS 26.0软件对实验数据进行单因素方差分析、主成分分析及隶属函数分析，运用Duncan检验法对显著性差异(P<0.05)进行多重比较；用Microsoft Excel 2016和Prism 6.0软件进行作图。相关指标计算如下：

主成分分析：根据特征值大于1的准则提取主成分Cl；

隶属函数值

其中x

权重w

w

耐热综合值(D):

5、结果与分析

5.1特定试剂能提高热胁迫下黄瓜幼苗的抗氧化物酶活性

对热胁迫中的黄瓜幼苗每天上午七点分别叶面喷施0.1g/Lγ-氨基丁酸(GABA)、0.1g/L壳聚糖(CTS)、1.0g/L氯化钙(CaCl2)和0.5g/L蔗糖(SUC)，以喷施去离子水为对照(CK)，热胁迫处理7天后测定SOD、POD及CAT活性。

结果如图1所示，在单一喷施四种试剂的四个处理组中，三种抗氧化物酶活性比对照组均有提升。以CAT酶活性为例，GABA、CTS、CaCl

5.2特定试剂能减缓热胁迫下黄瓜幼苗的膜脂氧化程度

高温胁迫会造成植物体内活性氧过多积累，细胞膜脂氧化程度加重，从而导致丙二醛(MDA)含量的上升。MDA含量越高说明细胞膜脂过氧化程度越严重，高温对植物造成的伤害越大。

结果如图2所示，在喷施外源试剂的四个处理组中，MDA含量较对照组都有所下降；GABA、CTS、CaCl

5.3特定试剂能增加热胁迫下黄瓜幼苗的色素含量

光合色素在光合作用中参与吸收、传递光能或引起原初光化学反应，光合色素的含量是影响光合作用的内因。

从图3所示的结果可以看出，单一喷施γ-氨基丁酸、壳聚糖、氯化钙和蔗糖，黄瓜叶片中叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总含量、类胡萝卜素含量相比于高温对照组整体呈上升趋势，且不同处理在不同色素含量上高低趋势大体一致。但四种试剂喷施对于提高色素含量存在差异。壳聚糖处理可提高叶绿素a含量、叶绿素b含量、叶绿素总含量；而蔗糖提高类胡萝卜素含量表现最佳。总的来说，四种试剂均能增加热胁迫下黄瓜幼苗的色素含量，且不同试剂在增加色素含量方面的效果不同。

5.4特定试剂能促进热胁迫下黄瓜幼苗热胁迫相关基因的表达

热激蛋白(HSP)是热胁迫诱导的功能蛋白，其编码基因受热激转录因子(HSF)的调控。AP2是植物特有的参与植物生长发育、响应生物和非生物胁迫过程的一类转录因子，已有研究表明，在热胁迫中，黄瓜体内该转录因子家族的基因表达量上调。

结果如图4所示，在喷施蔗糖和γ-氨基丁酸后，黄瓜内源HSF(CsaV3_2G025510)、HSP20(CsaV3_3G002770)、AP2(CsaV3_1G022920)基因表达量相对于其它处理组大幅度上升。此外，黄瓜体内这三种热胁迫相关基因的表达水平一致，即在某一处理组中，当HSF表达水平较高时，相应地，其体内的HSP20和AP2表达水平也相对较高。单一蔗糖处理组中，其体内上述基因的表达水平也更高。

综上，GABA、CTS、CaCl

综合不同处理在各个指标的表现情况，蔗糖在提高黄瓜幼苗耐热性上综合效果最佳。

5.5蔗糖能提高热胁迫下黄瓜幼苗的抗氧化物酶活性

由于叶面喷施蔗糖在提高黄瓜幼苗耐热性上效果显著，进一步设置了0.1g/L、0.5g/L、1.0g/L、2.5g/L、5.0g/L五个蔗糖浓度梯度，以喷施去离子水为对照(CK)，对测试植株进行处理。热胁迫处理7天后测定了新泰密刺和S19096两个品种下不同处理间的抗氧化物酶活性。

结果如图5所示，总体趋势来看，两品种的POD活性都先随蔗糖浓度增加而有先升后降的趋势。新泰密刺品种的CAT活性呈现波动，具体的以0.1g/L、0.5g/L、1.0g/L、2.5g/L四组处理较于CK其活性分别提高了16.0％、41.0％、42.9％、27.8％；5.0g/L蔗糖组降低了10.6％；SOD酶活数据显示，两品种也均表现为低浓度的蔗糖对提升SOD活性有促进作用，而高浓度效果不显著。由此可知过高的蔗糖浓度对于提高耐热性的效果反而不高；而适宜浓度的蔗糖对于热胁迫下两个品种的黄瓜幼苗的抗氧化物酶活性均有显著提高。

5.6蔗糖能减缓热胁迫下黄瓜幼苗的膜脂氧化程度

从图6可以看出，在新泰密刺品种中，0.1g/L、0.5g/L、1.0g/L蔗糖处理组较于CK处理，MDA含量分别下降了12.8％、26.2％、11.0％；同样处理在S19096品种中，MDA含量分别下降了25.9％、26.2％、8.9％；然而，两品种均在2.5g/L、5.0g/L蔗糖处理组中MDA含量分别与CK组无显著差异。

结果说明适宜浓度的蔗糖能减缓热胁迫下黄瓜幼苗的膜脂氧化程度，而高浓度蔗糖效果欠佳。

5.7蔗糖可增加热胁迫下黄瓜幼苗的色素含量

本发明随后测定了不同浓度的蔗糖处理对热胁迫下2个黄瓜品种不同光合色素含量的影响。

从图7所示结果可以看出，不同浓度蔗糖处理对于热胁迫下两品种黄瓜幼苗光合色素含量的影响呈现先上升后下降的总体趋势。

5.8蔗糖能促进热胁迫下黄瓜幼苗的热胁迫相关基因的表达

本发明推测，喷施蔗糖之所以能提高黄瓜幼苗的耐热性，可能与蔗糖能调控体内转录因子的表达有关，蔗糖处理过的热胁迫中的黄瓜幼苗，各项生理指标较CK更佳，且其体内与热胁迫有关的转录因子家族类的基因表达水平也有所上升。

由图8可知，在对热胁迫处理中的两黄瓜品种喷施不同浓度的蔗糖后，基因HSF、HSP20、AP2的表达相较于CK都会有所上升。这说明用蔗糖处理高温胁迫中的黄瓜幼苗能促进其热胁迫相关基因的表达。

5.9不同试剂处理对于提高黄瓜幼苗耐热性的综合效果

为综合所测定的指标参数从而更全面地反映不同处理间黄瓜的耐热性，本发明的评价方法综合了主成分分析法(PCA)和隶属函数法。主成分分析法可将多个显著相关且存在信息重叠的指标降维成几个相互独立且能反映原始数据大量信息的少数几个主成分，并对各个指标赋予权重；然后根据隶属函数法并采用主成分分析法计算出的数值进行计算，最后得出一个耐热综合值，根据此耐热综合值的高低来反映每个处理下黄瓜幼苗的综合耐热情况。

所测实验数据基于此综合方法计算的结果如表2、表3所示。从表2可知，所测定的耐热指标基于主成分分析被划分成三个独立的主成分Cl

表2基于主成分分析法计算各指标在不同主成分上的载荷情况

表3不同处理下黄瓜幼苗的耐热综合值

5.10特定试剂组合能提高热胁迫下黄瓜幼苗的抗氧化物酶活性

本发明以SUC与GABA、CTS的组合对热胁迫中两个品种的黄瓜幼苗进行叶面喷施，设置了1.0g/L蔗糖(SUC)，1.0g/L蔗糖+0.1g/Lγ-氨基丁酸(SUC+GABA)，1.0g/L蔗糖+0.1g/L壳聚糖(SUC+CTS)，1.0g/L蔗糖+0.1g/Lγ-氨基丁酸+0.1g/L壳聚糖(SUC+GABA+CTS)及去离子水(CK)五个处理。

从图9所示结果可以看出，SUC、SUC+GABA、SUC+CTS和SUC+GABA+CTS四个处理较于CK都能提高两个品种的SOD、POD和CAT酶活性，但不同处理间在提升酶活方面的效果有差异。例如在新泰密刺中，单一喷施蔗糖相较于CK组POD活性提高了47.2％；而SUC+CTS相较于CK组POD活性显著提高了103.8％。又比如在S19096中，SUC、SUC+GABA、SUC+CTS和SUC+GABA+CTS四相较于CK组POD活性均有显著提升。在SOD、CAT活性方面，不同处理组相较于CK组也都有不同程度的提升。可见，特定试剂组合能提高热胁迫下黄瓜幼苗的抗氧化物酶活性，且效果可能比单一喷施效果更优。

5.11特定试剂组合能减缓热胁迫下黄瓜幼苗的膜脂氧化程度

从图10所示结果可以看出，SUC、SUC+GABA、SUC+CTS和SUC+GABA+CTS组合喷施热胁迫中的新泰密刺后，丙二醛含量相较于CK分别显著降低了19.8％、21.0％、23.8％、22.0％；而在S19096中，SUC、SUC+GABA、SUC+CTS与CK也达到了显著性降低。因此得出特定试剂组合能减缓热胁迫下黄瓜幼苗的膜脂氧化程度。

5.12特定试剂组合能增加热胁迫下黄瓜幼苗的色素含量

由图11所示结果可知，在光合色素方面，单一喷施蔗糖以及蔗糖和不同试剂组合喷施均能不同程度提高两个品种的光合色素含量。对两品种而言，SUC、SUC+GABA、SUC+CTS和SUC+GABA+CTS处理后，黄瓜幼苗的叶绿素总含量相较于CK均有增加；类胡萝卜素含量以SUC+CTS和SUC+GABA+CTS处理提高较为显著；其中SUC+CTS组在两个品种中的叶绿素总含量、类胡萝卜素含量都最高，说明这一组合在增加热胁迫下黄瓜幼苗的色素含量方面效果最佳。

5.13特定试剂组合能促进热胁迫下黄瓜幼苗的热胁迫相关基因的表达

从图12可看出，对热胁迫处理中的新泰密刺品种喷施上述特定的组合试剂后，黄瓜内源HSF、HSP20、AP2的相对表达量较CK有所上升，但在S19096中，SUC+CTS可明显提高黄瓜体内的三个热胁迫相关的基因表达量。可见，复合试剂喷施能促进热胁迫中黄瓜幼苗某些热胁迫相关基因的表达。

5.14特定试剂处理能缓解黄瓜幼苗热胁迫伤害

本发明在对黄瓜幼苗进行持续7天的热胁迫处理并叶面喷施相应制剂后，观察不同处理下黄瓜幼苗的长势情况。结果如图13所示，热胁迫处理后黄瓜幼苗出现不同程度的萎蔫、叶片泛黄并呈现下垂等现象。在两品种中，均以CK组长势最弱，萎蔫程度最明显；其它四个处理组长势较好，叶片呈现较小幅度的萎蔫，但植株体型更加健壮，长势较快。结果表明喷施特定的外源制剂能缓解热胁迫对黄瓜幼苗造成的伤害，维持热胁迫下黄瓜幼苗的正常生长。

最后根据综合评价方法，对热胁迫下不同制剂处理后两个黄瓜品种的耐热性进行综合评价。从表4可知，在两个品种中，均以蔗糖+壳聚糖(SUC+CTS)组合的耐热综合值最高，耐热效果最佳。

表4不同试剂组合下黄瓜幼苗的耐热综合值

综上所述，以1.0g/L蔗糖+0.1g/L壳聚糖制剂效果最佳，其可显著提高黄瓜的耐热性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。