一种预防羊瘤胃感染腐败梭菌的复合饲料添加剂及制备方法

摘要

本发明公开了一种预防羊瘤胃感染腐败梭菌的复合饲料添加剂及制备方法，属于饲料添加剂技术领域，所述复合饲料添加剂由维生素A、维生素E、维生素B1、维生素B2、维生素C、胆碱、半胱胺酸、复合饲用酶制剂、复合肠道益生菌剂、复合药用真菌粗多糖发酵液、复合中药制剂、蒙脱石组成。本发明的复合饲料添加剂，在复合饲用酶制剂、复合肠道益生菌剂、复合中药制剂、维生素等作用下，改善饲料风味，提高饲料抗氧化与防霉变能力；提高饲料适口性、改善瘤胃微生态平衡、促进消化腺分泌，避免应激反应；发挥祛湿，行气和胃，解毒消肿，抑杀细菌的功效，使羊平稳适应天气的变化，实现增强羊免疫力和防病能力，显著预防腐败梭菌感染的效果。

说明书

技术领域

本发明涉及饲料添加剂技术领域，具体涉及一种预防羊瘤胃感染腐败梭菌的复合饲料添加剂及制备方法。

背景技术

腐败梭菌(Clostridium septium)是一类可形成芽孢的革兰氏阳性厌氧杆菌，常以芽胞形式存在于外界环境中，特别是低洼草地、耕地及沼泽之中。羊在采食和饮水过程中，芽孢随之进入消化道，因此许多羊平时消化道中就有该菌。该菌属于羊的消化系统的寄生细菌，生长速度缓慢，一般不会对羊产生损害。但当存在不良诱因，如秋冬、初春气候骤变，阴雨连绵，羊只受寒，或羊只采食了带冰霜的饲草料时，机体受到刺激，机体抵抗力降低，腐败梭菌大量增殖，产生α外毒素，损害真胃黏膜，引发炎症，引起机体发病。其发病症状主要表现为体温升高，食欲废绝，离群独处，卧地不起，不愿走动，强行行走表现虚弱和运动失调，磨牙，呼吸困难，头、喉、舌等部位黏膜肿胀，呈蓝紫色，口腔流出带血泡沫，常有不安、兴奋、突跃式运动或其他神经症状。有些羊表现腹胀，有疝痛样症状，排黑色软粪或稀粪，混有血液和黏液。病羊最后衰弱、昏迷而死，死前四肢痉挛、腹部膨胀，结膜急剧充血。而且，病死羊可成为传染源，促使腐败梭菌进一步侵染其他羊群，造成季节性流行的羊快疫，给农业生产造成严重的经济损失。

并且，羊快疫是一种急性致死传染病，一旦羊患上这种疾病会突然死亡，在羊生前确诊羊快疫比较困难。因此养殖户只能加强羊群管理和通过接种疫苗来预防此病。

发明内容

基于此，有必要针对目前因腐败梭菌所引起的羊只死亡甚至羊快疫等问题，通过以饲料添加剂的方式提高肉羊免疫力，从而显著预防腐败梭菌感染。

本发明针对北方舍饲环境，特别是冬末、初春的低温潮湿条件，以优化肠道菌群，改善羊肠道微生态，提高饲料利用率，避免氧化损伤为出发点设计饲料配方，提供了一种预防羊瘤胃感染腐败梭菌的复合饲料添加剂。

本发明的复合饲料添加剂由如下成分组成：维生素A 0.8～1.1份、维生素E0.75～1.2份、维生素B1 0.7～0.8份、维生素B2 7～8份、维生素C 3～6份、胆碱48～52份、半胱胺酸10～14份、复合饲用酶制剂3～14份、复合肠道益生菌剂10～25份、复合药用真菌粗多糖发酵液4～8份、复合中药制剂9.5～17份、蒙脱石580～610份。

优选地，所述复合饲用酶制剂由如下成分组成：纤维素水解酶1～5份、纤维素氧化酶1～3份；枯草芽孢杆菌扩张素蛋白1～6份。

优选地，所述复合饲用酶制剂中纤维素水解酶粉活力≥200FPU/g、纤维素氧化酶粉活力≥20FPU/g、枯草芽孢杆菌扩张素蛋白比活力≥100U/mg。

优选地，所述复合肠道益生菌剂由如下成分组成：枯草芽孢杆菌3～10份、植物乳杆菌4～7份、嗜酸乳杆菌3～8份。

优选地，所述复合肠道益生菌剂为菌粉制剂，活菌数≥10

优选地，所述复合药用真菌粗多糖发酵液由如下成分组成：桑黄粗多糖发酵液2～4份、灵芝粗多糖发酵液2～4份。

优选地，所述复合药用真菌粗多糖发酵液为将桑黄菌丝体和灵芝菌丝体分别接种于麦芽浸粉培养基中，28℃好氧培养5天所获得的粗发酵液。

优选地，所述复合中药制剂由如下成分组成：陈皮0.8～1.5份、甘草0.7～1份、仓术1～1.5份、生姜2～5份、桔梗5-8份。

本发明还提供了如前所述的预防羊瘤胃感染腐败梭菌的复合饲料添加剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)将维生素A、维生素E、维生素B1、维生素B2、维生素C、胆碱、半胱胺酸与蒙脱石混合均匀；

(2)再将复合饲用酶制剂、复合肠道益生菌剂和复合中药制剂依次加入，混合均匀；

(3)最后加入复合药用真菌粗多糖发酵液，混合均匀后干燥处理，控制复合饲料添加剂含水量低于5％。

优选地，所述步骤(3)中干燥处理是在45℃～55℃下加热烘干3～12h。

本发明不同于以往的多酶协同酶解方式，针对饲料中纤维素氢键众多，结晶区氢键网络复杂，单独纤维素酶水解效率差的情况，创造性的设计了三酶协同水解机制。首先，源于枯草芽孢杆菌的扩张素蛋白专一性的作用于纤维素结晶区，破坏纤维素分子间氢键，氢键破坏后氢键网断裂形成纤维素分子。其次，传统纤维素酶依靠内切葡聚糖酶水解纤维素分子效率较低，本发明加入纤维素氧化酶，该酶攻击纤维素分子C1和C4键，促进纤维素还原端形成，进而提高纤维酶解效率，更高效的转化纤维素饲草形成葡萄糖分子。本发明所用枯草芽孢杆菌，其淀粉酶活力和纤维素酶活力分别高达30U/g和55U/g，该菌可以在碱性厌氧条件下生长产酶，直接水解肉羊饲料中纤维类营养形成葡萄糖，植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌能够将葡萄糖转化成乳酸和乙酸，上述小分子有机酸更易于被羊肠道吸收转化为营养。上述微生物与酶的协同作用显著提高肉羊饲料消化率，改善了肠道健康，抑制了腐败梭菌生长。同时饲料添加剂中添加少量的桑黄和灵芝粗多糖发酵液，当肉羊瘤胃轻微受伤或者胃粘膜出现轻微炎症时，上述多糖能够避免氧化应急损伤，发挥抗菌消炎功效，同时也具有一定抑菌功效。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明的复合饲料添加剂设计了独特的三种酶协同作用的饲料粗纤维氧化水解体系，在枯草芽孢杆菌扩张素蛋白打断纤维素间氢键的基础上，纤维素氧化酶和纤维素水解酶同时对纤维素进行氧化、水解，促进粗纤维消化。并且，通过添加的枯草芽孢杆菌分泌淀粉酶，植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌加速淀粉向乳酸的转化，共同调节肠道菌群组成，抑制腐败梭菌的有害微生物增殖。由于三种酶的协同作用，纤维素快速分解，产生更多的葡萄糖，为后续的益生菌生长提供了充足碳源，益生菌快速生长的时候产生更多乳酸为羊提供营养，益生菌尿素循环效率显著增加，避免了尿素和氨态氮的积累，也减少了因为葡萄糖过量引起的高血脂问题。同时，发挥桑黄粗多糖、灵芝粗多糖、陈皮、甘草和仓术的活性调理功效，复配少量维生素A、维生素E和维生素C作为还原力，避免超氧自由基引发的胃肠膜系统的氧化损伤。

本发明的复合饲料添加剂，在复合饲用酶制剂、复合肠道益生菌剂、复合中药制剂、维生素等作用下，改善饲料风味，提高饲料抗氧化与防霉变能力；提高饲料适口性、改善瘤胃微生态平衡、促进消化腺分泌，避免应激反应；发挥祛湿，行气和胃，解毒消肿，抑杀细菌的功效，使羊平稳适应天气的变化，实现增强羊免疫力和防病能力。

具体实施方式

一种预防羊瘤胃感染腐败梭菌的复合饲料添加剂，所述复合饲料添加剂由如下成分组成：维生素A0.8～1.1份、维生素E 0.75～1.2份、维生素B1 0.7～0.8份、维生素B2 7～8份、维生素C 3～6份、胆碱48～52份、半胱胺酸10～14份、复合饲用酶制剂3～14份、复合肠道益生菌剂10～25份、复合药用真菌粗多糖发酵液4～8份、复合中药制剂9.5～17份、蒙脱石580～610份。

在其中一个较佳的实施例中，所述复合饲用酶制剂由如下成分组成：纤维素水解酶1～5份、纤维素氧化酶1～3份；枯草芽孢杆菌扩张素蛋白1～6份。

在其中一个较佳的实施例中，所述复合饲用酶制剂中纤维素水解酶粉活力≥200FPU/g、纤维素氧化酶粉活力≥20FPU/g、枯草芽孢杆菌扩张素蛋白比活力≥100U/mg。

在其中一个较佳的实施例中，所述复合肠道益生菌剂由如下成分组成：枯草芽孢杆菌3～10份、植物乳杆菌4～7份、嗜酸乳杆菌3～8份。

在其中一个较佳的实施例中，所述复合肠道益生菌剂为菌粉制剂，活菌数≥10

在其中一个较佳的实施例中，所述复合药用真菌粗多糖发酵液由如下成分组成：桑黄粗多糖发酵液2～4份、灵芝粗多糖发酵液2～4份。

在其中一个较佳的实施例中，所述复合药用真菌粗多糖发酵液为将桑黄菌丝体和灵芝菌丝体分别接种于麦芽浸粉培养基中，28℃好氧培养5天所获得的粗发酵液。

在其中一个较佳的实施例中，所述复合中药制剂由如下成分组成：陈皮0.8～1.5份、甘草0.7～1份、仓术1～1.5份、生姜2～5份、桔梗5-8份。

如前所述的预防羊瘤胃感染腐败梭菌的复合饲料添加剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)将维生素A、维生素E、维生素B1、维生素B2、维生素C、胆碱、半胱胺酸与蒙脱石混合均匀；

(2)再将复合饲用酶制剂、复合肠道益生菌剂和复合中药制剂依次加入，混合均匀；

(3)最后加入复合药用真菌粗多糖发酵液，混合均匀后干燥处理，控制复合饲料添加剂含水量低于5％。

在其中一个较佳的实施例中，所述步骤(3)中干燥处理是在45℃～55℃下加热烘干3～12h

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

实施例1饲料添加剂的配比选择及肉羊饲养管理

选取健康状况良好的育肥羊羔80只，基础性状(如初始空腹体重等)相近，完成“五联苗”、厌氧菌七联干粉苗免疫，初始体重15kg左右。育肥分5个阶段：调理期15天，过渡期15天，育肥前期30天，育肥中期30天，育肥后期30天，共120天，其中育肥实验90天，调理期和过渡期，确认肉羊健康、适应环境，完成驱虫与免疫工作。羊分成4组，每组20只，公、母各10只分栏喂养。设置复合饲料添加剂Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ，具体配比见表1，使用量为每1kg饲料加入复合添加剂10g。对照组为无复合饲料添加剂组，其他条件完全一致。全舍饲饲养，自由采食，自由饮水，自由舔砖，圈舍中自由活动，当天投料重量比前1天实际采食量高10％。每天清扫圈舍，一周消毒一次，保持圈舍干净。动物福利3R原则的指导下进行规划和实施，最大限度保障整个试验过程中动物的福利。

表1复合饲料添加剂Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ的具体配比

实施例2肉羊生长性能的测定

每天7:00，计算前一天肉羊饲料采食量，测定肉羊空腹体重(晨饲前体重)和饲料单日采食量，计算平均日增重，同时按照如下公式计算料重比，结果见表2。

日增重(g/d)＝(各阶段末体重-各阶段初始体重)/饲喂天数；

采食量(g/d)＝(各阶段饲料投放量-各阶段余料量)/饲喂天数；

料重比＝总采食量/总增重。

表2复合饲料添加剂对育肥羊生长性能的影响

实施例3肉羊养分表观消化率的测定

育肥后期最后3天，每天收集5个以上羊粪样品，充分混匀，105℃烘干，磨碎过40目网筛，按照如下方法测定粪样和饲料样品的干物质、粗脂肪、粗蛋白质、中性洗涤纤维及酸性洗涤纤维含量，结果见表3。

干物质：每一个育羊阶段结束前第3天开始，每天收集5个以上羊粪样品，充分混匀后分成3份，每一份新鲜重50g以上，立即在105℃烘干至恒重，用于测定干物质含量。

计算公式：水分含量：ω(水分)＝(m1-m2)/(m1-m0)；

式中：m1为烘干前试样+称量瓶质量，单位g；m2为烘干后试样及称量瓶质量，单位g；m0为称量瓶质量，单位g。

干物质含量＝1–ω；

干物质消化率(％)＝(饲料中干物质总质量－粪便中干物质总质量)/饲料中干物质总质量×100％。

粗脂肪：采用索氏抽提法，将溶剂烧杯清洗干净放入100℃烘箱烘2～3h，烘干后放入干燥器中1h(放置冷却时吸湿)，称重并记录重量m1(精确至0.0001)。准确称取烘干粉碎后的羊粪样品(m0)1.0g包于滤纸中，平放入砂芯样品杯底部，将砂芯杯放入脂肪抽提器内，连接已干燥至恒重的溶剂烧杯，在溶剂烧杯中加入100～120mL石油醚，于水浴上加热，使石油醚不断回流提取。抽提结束后，取下样品砂芯杯瓶，回收石油醚，待烧杯中石油醚剩1～2mL时在水浴上蒸干，再于100℃干燥2h，放入干燥器内冷却0.5h后称重并记录重量m2。

计算公式：ω(粗脂肪)＝(m2-m1)/m0；

式中：m0为样品质量，单位g；m1为溶剂烧杯质量，单位g；m2为盛有脂肪的溶剂烧杯质量，单位g。

粗脂肪消化率(％)＝(饲料中粗脂肪总质量－粪便中粗脂肪总质量)/饲料中粗脂肪总质量×100％。

粗蛋白：采用凯氏定氮法

①试样的消煮：称取0.5～1g试样(含氮量5～80mg)准确至0.002g无损失地放入凯氏烧瓶中，加入硫酸铜0.9g无水硫酸钾15g与试样混合均匀再加硫酸25mL和2粒玻璃珠在消煮炉上小心加热待样品焦化泡沫消失再加强火力(360～410℃)直至溶液澄清后再加热至少2h。

②氨的蒸馏：将①中的试样消煮液冷却，加蒸馏水200mL摇匀冷却。沿瓶壁小心加入40％氢氧化钠溶液100mL，立即与蒸馏装置相连，蒸馏装置冷凝管的末端应浸入50mL硼酸吸液1mL。加混合指示剂2滴，轻摇凯氏烧瓶使溶液混匀加热蒸馏直至馏出液体积约150mL。先将吸收液取下再停止加热。

③滴定：吸收氨后的吸收液立即用0.05M盐酸标准溶液滴定，溶液由蓝绿色变为灰红色即为滴定终点。

④空白测定：称取蔗糖0.5g，代替试样，另取凯氏烧瓶一个，加入无水硫酸铜(CuSO·5H

计算公式：粗蛋白质(％)＝(V1-V2×C×0.0140×6.25)/[m×(V'/V)]×100％

式中：V1为滴定试样时所需酸标准溶液体积，单位mL；V2为滴定空白时所需酸标准溶液体积，单位mL；C为盐酸标准滴定溶液的浓度，单位mol/L；m为试样重量，单位g；V为试样分解液总体积，单位mL；V′为试样分解液蒸馏用体积，单位mL；0.0140为氮的毫克当量数；6.25为氮换算成蛋白质的平均系数。

粗蛋白消化率(％)＝(饲料中粗蛋白总质量－粪便中粗蛋白总质量)/饲料中粗蛋白总质量×100％。

中性洗涤纤维：准确称取绝干的羊粪样品(m0)1.0g放入滤袋中，在100℃烘箱中烘干4h，取出在干燥器中冷却，精确称重并记录重量m1，滤袋重量(m1-m0)。将滤袋放入烧杯中，按照每个滤袋50mL中性洗涤剂的比例加入洗液，在电炉上煮沸1h，在此过程中将加入冷水的圆底烧瓶放置其上使其冷凝回流。用蒸馏水冲洗煮过的滤袋，再用无水乙醇洗涤3次左右；将滤袋置于100℃烘箱中烘干4h，冷却后精确称重并记录重量m2。

计算公式：ω(中性洗涤纤维)＝m2-(m1-m0)/m0

式中:m0为样品质量，单位g；m1为滤袋+样品质量，单位g；m2为洗脱后滤袋质量，单位g；

中性洗涤纤维消化率(％)＝饲料中中性洗涤纤维总质量－粪便中中性洗涤纤维总质量/饲料中中性洗涤纤维总质量×100％。

酸性洗涤纤维：将上述测定完中性洗涤纤维的滤袋放入烧杯中，按照每个滤袋50mL 2M HCl溶液的比例加入洗液，在电炉上煮沸50min，在此过程中将加入冷水的圆底烧瓶放置其上使其冷凝回流；将煮过的滤袋用水冲洗到pH为6.5～7.0，并用无水乙醇洗涤3次左右；将滤袋置于100℃烘箱内烘干4h，精确称重并记录重量：m3。

计算公式：ω(酸性洗涤纤维)＝(m3-(m1-m0)/m0

式中：m0为样品质量，单位g；m1为滤袋+样品质量，单位g；m3为洗脱酸性洗涤纤维后滤袋质量，单位g。

酸性洗涤纤维消化率(％)＝饲料中酸性洗涤纤维总质量－粪便中酸性洗涤纤维总质量/饲料中酸性洗涤纤维总质量×100％。

表3复合饲料添加剂对育肥羊营养物质表观消化率的影响

通过表2和表3的数据，说明在复合饲用酶制剂提高饲料纤维素转化率以产生更多还原糖提供碳源营养的情况下，复合肠道益生菌剂中的益生菌在肉羊肠道内快速生长，能够更好地为羊提供营养，提高了饲料利用率。

实施例4肉羊腹泻率与死亡率的测定

育肥前期、中期、后期，每天8:00开始观察收集粪便，记录腹泻次数。粪便分为正常、稀软、黏稠、水样和血便5个等级，后4个等级为腹泻。育肥羊发病后及时隔离治疗，死亡后及时解剖分析病因，确认是否腐败梭菌引起。按照如下公式计算腹泻率、腐败梭菌发病率和腐败梭菌死亡率，结果见表4。

腹泻率(％)＝[腹泻只数/(试验只数×试验天数)]×100％。

腐败梭菌发病率(％)＝(发病羊只数/总羊只数)×100％。

腐败梭菌死亡率(％)＝(死亡羊只数/总羊只数)×100％。

表4复合饲料添加剂对肥羊腹泻率及梭菌发病死亡率的影响

通过上表数据可知，复合饲用酶制剂的加入显著提高了饲料纤维素转化率，产生更多还原糖，同时复合肠道益生菌剂在更多还原糖提供碳源营养的前提下，迅速生长，肉羊肠道微生物菌群得到改善，腐败梭菌生长受到抑制，其他一些维生素和复合药用真菌粗多糖发酵液也起到了抗氧化、免疫调节的功效。

实施例5肉羊腹泻率与死亡率的测定

育肥后期最后1天8:00，所有试验羊只空腹静脉采血10mL于未加抗凝剂的离心管中，待其凝固后高速离心10min，吸取上清液于EP管中，置于-80℃冻存。测定生化指标时，冻存血清取出在37℃水浴中解冻，按照试剂盒说明书的剂量要求吸取血清样本用全自动生化分析仪测定碱性磷酸酶活性及总蛋白、白蛋白、球蛋白、尿素氮、甘油三酯、葡萄糖浓度，结果见表5。

表5复合饲料添加剂对肥羊血清生化指标的影响

通过上表数据可知，复合饲料添加剂未引起育肥羊肝功和肾功损伤，复合肠道益生菌剂及复合中药制剂的施用避免育肥羊采食颗粒饲料过程中引发的高血脂症，微生物通过尿素循环，减少了尿素氮的含量，更多蛋白质贮存在肉羊体内。

实施例6肉羊瘤胃和肠道组织形态结构的测定

屠宰后，在每只育肥羊的瘤胃同一处分别取一块瘤胃腹囊和回肠、结肠中段用生理盐水冲洗干净后放置于4％的多聚甲醛溶液固定。之后从固定好的样本组织中取出瘤胃和肠道样品，瘤胃组织切成0.5cm×0.5cm的厚度均匀的小方块，肠道组织切成厚度不超过包埋盒厚度的小块，放入包埋盒中并做好标记，然后进行组织冲洗，冲洗时间为36～48h。冲洗结束后放入到自动脱水机进行脱水处理；脱水完毕后取出包埋盒用石蜡对组织样本进行包埋，包埋成为组织蜡块以后将其切成4.5～5.5mm的薄片，随后放置在37℃的烘箱中6～8h，烘干后上用苏木精－伊红(Hematoxylin/eosin，HE)染色，最后用利用中性树胶进行手动封片。然后使用光学显微镜在4×放大倍数下进行显微图像采集分析，测量瘤胃组织和肠道组织的生长发育评价指标。结果见表6。

表6复合饲料添加剂对育肥羊屠宰性能和肉品质的影响

通过上表数据可知，瘤胃和肠道组织观察表明因为复合肠道益生菌剂及复合中药制剂的加入，育肥羊肠道微生物更加健康，避免了腐败梭菌等病原微生物的生长，瘤胃品质更高。

虽然在实施例中已经通过一般性说明、具体实施方式及试验对本发明作出了详尽的描述，但在不偏离本发明核心的基础上，仍可以作出的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。