小麦冻害抗性基因及其编码蛋白和应用

摘要

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种小麦冻害抗性基因

说明书

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种小麦冻害抗性基因TaCOCO1及其编码蛋白和应用。

背景技术

小麦是全世界种植面积最大、分布最广、总产量最多的粮食作物，全世界35％以上人口的主食为小麦。近年来气候多变，异常天气频繁发生，低温、高热、干旱等非生物胁迫对作物生产造成了极大影响。低温胁迫是一种对小麦生长和农业生产力有不利影响的非生物胁迫。低温胁迫会干扰蛋白质或蛋白质复合物的稳定性，从而使代谢调节受到干扰。低温胁迫还会影响光合作用，从而对作物的产量造成间接影响，除此之外，ROS以及过氧化氢(H

小麦抗寒性是一个复杂的性状，它可能受到遗传因素和环境的影响。目前在小麦中鉴定到两个主要的与小麦抗寒性相关的QTL，Fr-1(Frost Resistance-1)和Fr-2(FrostResistance-2)，由于Fr-1与Vrn-1的物理位置接近，所以被认为是Vrn-1的多效性效应，Fr-2可能是CBF基因的拷贝数变异(Würschum T,Longin CF,Hahn V,Tucker MR,Leiser WL.(2017)Copy number variations of CBF genes at the Fr-A2 locus are essentialcomponents of winter hardiness in wheat.Plant J.89(4):764-773.)。除此之外，TaDREB3、TaCBF5L被鉴定响应冻害胁迫(Yang Y,Al-Baidhani HHJ,Harris J,Riboni M,LiY,Mazonka I,Bazanova N,Chirkova L,Sarfraz Hussain S,Hrmova M,Haefele S,LopatoS,Kovalchuk N.(2020)DREB/CBF expression in wheat and barley using the stress-inducible promoters of HD-Zip Igenes:impact on plant development,stresstolerance and yield.Plant Biotechnol J.18(3):829-844.)。ICE-CBF途径是在植物中广泛存在的参与冻害胁迫响应的过程，在小麦中，TaICE41和TaICE87与TaCBFIVd-B9启动子中的MYC元件结合并激活TaCBFIVd-B9的表达，进而使植物产生抗冻性(Badawi M,ReddyYV,Agharbaoui Z,Tominaga Y,Danyluk J,Sarhan F,Houde M.(2008)Structure andfunctional analysis of wheat ICE(inducer of CBF expression)genes.Plant CellPhysiol.49(8),1237-1249.)。

由于小麦基因组的复杂性，且冻害受复杂的遗传背景以及环境条件的影响，小麦中冻害相关基因挖掘工作进展缓慢，因此，发掘和利用优良抗寒基因，并从分子水平上阐明其遗传机制，探究抗寒基因参与的调控途径，实现基因聚合利用，对小麦抗寒育种具有十分重要的意义。

发明内容

本发明提供了一种小麦冻害抗性基因TaCOCO1及其编码蛋白和应用，旨在解决小麦冻害抗性基因缺乏的技术问题，为小麦抗逆育种提供更多的选择。

本发明采用以下技术方案：

本发明筛选得到一种小麦冻害抗性基因TaCOCO1，其基因组核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，其长度为4828bp，含有5个外显子和4个内含子；TaCOCO1基因的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其长度为1512bp；TaCOCO1基因的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，为序列SEQ ID NO.2中自5'末端第28～1197位的脱氧核糖核苷酸，并编码如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，氨基酸的个数为390。

本发明提供了一种扩增上述基因TaCOCO1的引物对，该引物对的核苷酸序列如下所示：

TaCOCO1-1F：5’-TAGATCAGCTACGCCAGCCTC-3’；

TaCOCO1-1R：5’-CACCCACACAAGGCCATCAG-3’；

TaCOCO1-2F：5’-ATGACGCTCCTGGGTTGGAT-3’；

TaCOCO1-2R：5’-CTATAATTCCAGTACCAGGT-3’。

以小麦基因组DNA为模板，用TaCOCO1-1F和TaCOCO1-1R组成的引物对进行PCR扩增得到的DNA片段为TaCOCO1基因的基因组序列；

以小麦的cDNA为模板，用TaCOCO1-1F和TaCOCO1-1R组成的引物对PCR扩增得到的DNA片段为TaCOCO1基因的cDNA序列；

以TaCOCO1基因的cDNA序列为模板，用TaCOCO1-2F和TaCOCO1-2R组成的引物对进行巢式PCR扩增得到的DNA片段为TaCOCO1基因的CDS序列。

本发明还提供了一种含有小麦冻害抗性基因TaCOCO1或TaCOCO1基因的CDS的植物表达载体，例如将上述小麦冻害抗性基因TaCOCO1或TaCOCO1基因的CDS插入LGY-OE3植物过表达载体中而成的。使用基因TaCOCO1或TaCOCO1基因的CDS构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸(ATG)前可加上任何一种增强启动子或者诱导型启动子；为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，比如加入植物可选择性标记(GUS基因、荧光素酶基因等)或具有抗性的抗生物素标记物(庆大霉素、卡那霉素等)。

本发明还提供了含有上述植物表达载体的重组菌。

本发明还将上述小麦冻害抗性基因TaCOCO1、TaCOCO1基因的CDS、基因TaCOCO1所编码的蛋白、植物表达载体或所述重组菌应用在小麦抗逆(具体为抗冻害)育种当中或提高小麦抗冻性中。

本发明还提供一种提高小麦抗冻害的方法，具体的，在小麦中过表达所述小麦冻害抗性基因TaCOCO1。操作方式为：将包含小麦冻害抗性基因TaCOCO1的植物表达载体转化到小麦的未成熟胚中，筛选获得转基因阳性株系。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次公开、并确认了一种新的小麦冻害抗性相关基因TaCOCO1，该基因位于小麦6B染色体上，其表达的蛋白可调控小麦冻害抗性；利用农杆菌介导的转化系统将携带有基因TaCOCO1的植物表达载体转化小麦幼胚，与野生型Fielder相比，过表达阳性植株的抗冻性明显增强，且其相对电导率与野生型相比显著降低，相对含水量与野生型相比显著升高，表明TaCOCO1为小麦冻害抗性基因。

本申请TaCOCO1基因有助于揭示小麦冻害抗性的分子遗传基础，能够为小麦抗逆育种提供重要的基因资源，为高产稳产优质小麦新品种培育提供新的途径。

附图说明

图1为本发明实施例二中野生型Kronos和TaCOCO1突变体(K2716和K4061)在低温处理后的表型比较图。

图2为本发明实施例二中野生型Kronos和TaCOCO1突变体(K2716和K4061)在低温处理后生理指标(相对电导率和相对含水量)的含量比较图。

图3为本发明实施例三中LGY-OE3载体质粒图谱。

图4为本发明实施例三中TaCOCO1在其过表达株系(OE-1、OE-2和OE-3)与对照野生型Fielder中的相对表达量图。

图5本发明实施例四中过表达株系(OE-1、OE-2和OE-3)与对照野生型Fielder低温处理后的表型图。

图6本发明实施例四中过表达株系(OE-1、OE-2和OE-3)与对照野生型Fielder低温处理后生理指标(相对电导率和相对含水量)的含量比较图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂、载体等试验材料如无特别说明，均为市售常规产品；所涉及的试验方法、检测方法等，如无特别说明，均为常规方法。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。引物合成及测序工作均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

实施例所涉及的小麦材料：

由黄淮麦区有代表性的243份小麦品种/系组成的自然群体(详见表1)，采用覆盖全基因组的660K SNP芯片(SunC,DongZ,ZhaoL,RenY,ZhangN,ChenF.(2020)The Wheat660KSNP array demonstrates great potential for marker-assisted selection inpolyploid wheat.Plant Biotechnol J.18(6):1354-1360.)进行基因分型，此群体用于全基因组关联分析(GWAS)。

表1.黄淮麦区有代表性的243份小麦品种/系组成的自然群体

四倍体小麦Kronos突变体：野生型Kronos，K2716和K4061(均为B基因组中TaCOCO1基因的提前终止类型)突变体材料，用于比对TaCOCO1基因效应；两种突变体材料购自加利福尼亚大学戴维斯分校(UC Davis)，上述材料由该校的Jorge Dubcovsky小组使用EMS诱变产生。

Fielder材料：野生型Fielder。

实施例一：通过全基因组关联分析(GWAS)进行小麦冻害抗性基因的挖掘，具体如下：

1.群体种植

用于全基因组关联分析的243份小麦品种，于2017～2018和2020～2021年种植于河南农业大学原阳科教园区，群体每年种植两次重复，每次重复进行两次表型调查，表型调查于小麦苗期进行，在每年的3月和4月份进行调查。每个品种分两行种植，每行15株，行间和行内植株间距分别为20cm和10cm。试验田按照标准进行管理，整个生长期间无干旱及病虫害的发生。

2.表型调查

参照Zhang等(Zhang N,Huo W,Zhang L,Chen F,Cui D.(2016)Identificationof Winter-Responsive Proteins in Bread Wheat Using Proteomics Analysis andVirus-Induced Gene Silencing(VIGS).Mol Cell Proteomics.15,2954-2969.)的方法，将冻害等级分为四级(3，2，1，0)。其中3级为敏感、2级为中度敏感、1级为中抗、0级为抗。

3.小麦冻害抗性基因挖掘

将调查得到的表型数据与群体660K SNP芯片基因型进行结合(北京康普森生物技术有限公司)，质控后进行全基因组关联分析(GWAS)，鉴定出与小麦冻害显著相关的SNP位点，利用这些SNP位点，参照EnsemblPlants数据库中的中国春基因组数据信息进行BLAST，发现这些SNP位点锁定区段位于小麦6B染色体的712.2～720.9Mb间。进一步结合转录组进行分析，显示候选区间内的110个基因中有10个受到低温诱导表达；组织表达特异性分析显示其中有7个基因在叶片、茎以及根中特异性表达。为了进一步确定候选基因，对上述7个基因进行测序，将基因多态性位点插入660K SNP芯片重新进行GWAS分析，发现区段内有一个注释为WRKY transcription factor-like protein的基因，其启动子区的一个变异位点在多个环境被显著检测到，因此将该基因预测为小麦冻害性状相关基因。

在已公布的中国春参考序列基础上，对小麦中国春中的TaCOCO1进行克隆，最终得到一个完整的开放阅读框。

具体步骤如下：

①DNA的提取：利用SLS法提取中国春苗期的DNA。

具体实施步骤如下：(1)取苗期小麦叶片放入2mL含有钢珠的离心管中，放入液氮中速冻，随后用研磨机进行研磨，加入800μL SLS，摇20min，使其充分混匀；所述SLS含288mMNaCl，200mM Tris-HCl，25mM EDTA，0.5％ SDS。

(2)随后加入等体积的三合一(苯酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1)。

(3)摇10min，使其充分混匀。

(4)12,000rpm离心15min，移上清至另一新的2mL离心管中，加入等体积预冷的异丙醇进行DNA的抽提。静置10min。

(5)12,000rpm离心15min，弃上清，加入0.5mL 75％(体积百分含量)乙醇水溶液，静置5min。

(6)12,000离心5min，弃上清，得沉淀。真空干燥后加入100μLTE溶解沉淀，即得为小麦叶片基因组DNA。

②总RNA提取及反转录：利用TRIzol法分别提取小麦品种中国春的总RNA。取2μLRNA在2％琼脂糖上电泳，检测RNA的完整性，发现提取的总RNA具有基本清晰的28S和18S的主带；紫外分光光度计检测OD

③TaCOCO1基因的克隆以及序列分析

设计巢式PCR引物，TaCOCO1-1F和TaCOCO1-1R分别设计在起始密码子ATG和终止密码子TAG两端；TaCOCO1-2F和TaCOCO1-2R分别设计在起始密码子ATG和终止密码子TAG的位置，分别如下：

TaCOCO1-1F：5’-TAGATCAGCTACGCCAGCCTC-3’；

TaCOCO1-1R：5’-CACCCACACAAGGCCATCAG-3’；

TaCOCO1-2F：5’-ATGACGCTCCTGGGTTGGAT-3’；

TaCOCO1-2R：5’-CTATAATTCCAGTACCAGGT-3’。

以中国春的DNA为模板，用TaCOCO1-1F和TaCOCO1-1R组成的引物对进行PCR扩增。PCR扩增体系见表2，PCR扩增程序见表3。

表2.TaCOCO1-1F和TaCOCO1-1R组成的引物对对TaCOCO1基因的PCR扩增体系

表3.TaCOCO1-1F和TaCOCO1-1R组成的引物对对TaCOCO1基因PCR扩增程序

PCR产物进行1％琼脂糖胶电泳，回收后连接到pMD-18T载体(Takara)，送上海生工进行测序。

用上述类似的方法再以中国春的cDNA为模板，用TaCOCO1-1F和TaCOCO1-1R组成的引物对进行PCR扩增；以PCR产物为模板，用TaCOCO1-2F和TaCOCO1-2R组成的引物对进行巢式PCR扩增，电泳，回收后连接到回收后连接到pMD-18T载体(Takara)，送上海生工进行测序。PCR反应体系同上述方法。PCR参数：95℃5min，95℃30s，60℃30s，72℃1.2min，35个循环。

测序结果表明，以中国春的DNA为模板，用TaCOCO1-1F和TaCOCO1-1R组成的引物对进行PCR扩增得到的DNA片段为TaCOCO1基因的基因组序列，如SEQ ID NO.1所示，其长度为4828bp，含有5个外显子和4个内含子；以中国春的cDNA为模板，用TaCOCO1-1F和TaCOCO1-1R组成的引物对PCR扩增得到的DNA片段为TaCOCO1基因的cDNA序列，如SEQ ID NO.2所示，其长度为1512bp；以TaCOCO1基因的cDNA序列为模板，用TaCOCO1-2F和TaCOCO1-2R组成的引物对进行巢式PCR扩增得到的DNA片段为TaCOCO1基因的CDS序列，如SEQ ID NO.3所示，其长度为1170bp，为序列SEQ ID NO.2自5'末端第28～1197位的脱氧核糖核苷酸，并编码如序列表SEQ ID NO.4所示的蛋白，该蛋白的氨基酸的个数为390。

实施例二：TaCOCO1的突变体表型鉴定及生理指标测定

将四倍体小麦Kronos(野生型)的EMS诱变突变体经过3代自交和表型性状观察，调查农艺性状，待单株表型稳定后，形成基因型纯合的突变体系。经过对突变体库的筛选，发现两个TaCOCO1提前终止的类型，并命名为K2716(G-585A)、K4061(C-596T)。

将纯合突变的株系与野生型Kronos种植于温室中，待长到两叶一心期，进行低温处理。如图1所示，在低温处理前，野生型和突变体生长状态并无明显差异，经低温处理后，野生型表现出比突变体更耐冻的表型。相关生理指标(相对电导率和相对含水量)的测定参照Zhang等(Zhang N,Huo W,Zhang L,Chen F,Cui D.(2016)Identification of Winter-Responsive Proteins in Bread Wheat Using Proteomics Analysis and Virus-Induced Gene Silencing(VIGS).Mol Cell Proteomics.15,2954-2969.)的方法。相对电导率采用抽气法进行测定，具体步骤如下：取大小相当的植物叶片(0.5g左右，尽量保证叶片的完整性,少含茎节)，用自来水冲洗后再用蒸馏水冲洗干净，用滤纸吸净表面水分。避开主脉将叶片切割成大小一致的叶块，混合均匀，称量0.1g放入装有6mL去离子水的离心管中，利用真空泵进行不断抽气放气，直至叶片完全沉入水底，将抽真空后的叶片在离子水中处理3h，用电导仪测定浸提液电导(R1)，然后沸水浴加热30min，冷却至室温后摇匀，再次测定浸提液电导(R2)，重复三次。相对电导率＝R1/R2×100％。三次重复，结果取平均值。如图2A所示，与野生相比，在冻害处理后，突变体的相对电导率明显上升。

相对含水量的测定用烘干法，具体步骤如下所示：取大小相当的植物叶片，将叶片切割成大小相当的叶块，称取鲜重。随后将叶块放入培养皿中，加入去离子水，放置一夜，让叶片充分吸水，第二天用滤纸吸干表面水分，称取饱和重；随后将叶块重新放入培养皿中，封口，放入烘箱中进行烘干，待完全烘干后，称取干重。相对含水量的计算公式为：相对含水量＝(鲜重-干重)/(饱和重-干重)×100％。三次重复，结果取平均值。如图2B所示，与野生相比，在冻害处理后，突变体的相对含水量明显下降。

实施例三：TaCOCO1转基因小麦的获取

1.TaCOCO1植物过表达载体的构建

根据实施例一中克隆得到的TaCOCO1的全长cDNA序列设计保护引物，引入限制性内切酶BamH I和Sac I识别位点及保护碱基，引物序列如下：

TaCOCO1-3F：5’-GGATTCATGACGCTCCTGGGTTGGAT-3’；

TaCOCO1-3R：5’-GAGCTCCTATAATTCCAGTACCAGGT-3’。

表达载体选择LGY-OE3，其携带有玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，载体图谱如图3所示。

将实施例一中的1170bp的DNA片段(TaCOCO1基因的CDS序列)克隆入植物表达载体LGY-OE3的酶切位点BamH I和Sac I之间，得到含有小麦TaCOCO1基因的重组表达载体，命名为LGY-OE3-TaCOCO1。

2.TaCOCO1转基因小麦的获得

将LGY-OE3-TaCOCO1用农杆菌侵染法转化小麦野生型Fielder的幼胚愈伤组织，经过筛选、预分化、分化得到转基因小麦植株。

3.转基因小麦的阳性鉴定

首先利用潮霉素标签引物(Hyg)引物Hyg-F和Hyg-R引物对T

Hyg-F：5’-TCTGCACCATCGTCAACCAC-3’；

Hyg-R：5’-AAACCCACGTCATGCCAGTT-3’。

共获得15个转基因阳性植株，经过室内加代，得到了T

4.转基因株系的表达量鉴定

利用TaCOCO1-4F和TaCOCO1-4R引物，序列如下：

TaCOCO1-4F：5’-AGTGGAGGGTGAAGGATGAG-3’；

TaCOCO1-4R：5’-TTGCGGTTCTTCTTGGTCAG-3’。

实时荧光定量检测TaCOCO1在T

实施例四：TaCOCO1转基因小麦的冻害处理后表型鉴定以及生理指标测定

将实施例三得到的T

综上所述，本申请所述小麦冻害响应基因TaCOCO1可以增强小麦的抗冻性。可用于进一步研究TaCOCO1在小麦响应冻害方面的分子机制，在小麦抗逆育种方面具有重要的应用价值。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。