大豆抗逆相关蛋白GmSQLE1及其编码基因在调控植物抗逆性中的应用

摘要

本发明公开了大豆抗逆相关蛋白GmSQLE1及其编码基因在调控植物抗逆性中的应用。具体地公开了氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质及其编码基因在调控植物抗逆性中的应用。本发明通过将来源于大豆的GmSQLE1基因导入到受体植物中，得到了转GmSQLE1基因的纯合植株。实验证明，与未转基因受体对照相比，在干旱胁迫和盐胁迫条件下，转基因拟南芥和大豆均表现出了更强的耐受性，存活率均显著高于受体对照，长势也显著优于受体对照，表明GmSQLE1基因的过表达可以显著提高植物的抗干旱胁迫能力和耐盐能力(即提高了植物的抗逆性)。本发明的调控植物抗逆性基因对于培育植物的抗逆新品种具有重要的意义和应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及大豆抗逆相关蛋白GmSQLE1及其编码基因在调控植物抗逆性中的应用。

背景技术

植物在生长发育过程中，随时面临着各种非生物逆境胁迫，如干旱、高盐及低温等，这些逆境胁迫对植物的生长发育产生了严重影响。植物抗逆机理研究和培育抗逆新品种一直是农业可持续发展的重大需求。非生物胁迫能够引起植物生理性状和新陈代谢的改变，在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学依据。

在干旱、高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。在长期的进化过程中，从对逆境信号的感知、胞间转导和传递到最终表达各种逆境基因，产生适应性，形成了一些列复杂的逆境信号传递的分子机制。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。除传统育种外，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞和分子水平，因此，挖掘抗逆相关基因，并将其应用于作物遗传育种，将成为改良作物某一抗逆性状的有效手段，对于培育抗逆新品种、提高作物的抗逆性具有重要的理论指导意义和实践应用价值。

大豆(Glycine max(Linn.)Merr.)是一种重要的粮食作物和油料作物，其种子富含蛋白质，是世界上70％可食用蛋白质的来源，同时也是生物柴油的新兴原料。随着全球气候变化和自然灾害的频繁发生，大豆在生长发育过程中会受到各种环境胁迫的危害，尤其是干旱、高盐和低温等逆境胁迫是影响大豆生长、发育的障碍因子，严重影响大豆的产量和品质，因此，研究大豆对逆境条件的应答与信号传导机制，提高大豆的抗逆性，成为大豆遗传研究及大豆品种改良的重要任务之一。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的抗逆性。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质的应用，所述应用可为下述任一种：

D1)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在调控植物抗逆性中的应用；

D2)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备调控植物抗逆性的产品中的应用；

D3)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在培育抗逆植物中的应用；

D4)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备培育抗逆植物的产品中的应用；

D5)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在植物育种中的应用；

所述蛋白质名称为GmSQLE1，可为下述任一种：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。

所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质GmSQLE1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质GmSQLE1的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质GmSQLE1且具有蛋白质GmSQLE1功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质GmSQLE1。

上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

所述调控基因表达的物质具体可为B1)-B3)中任一所述的生物材料。

上述应用中，所述蛋白质可来源于大豆(Glycine max(Linn.)Merr.)。

本发明还提供了与所述蛋白质GmSQLE1相关的生物材料的应用，所述应用可为下述任一种：

E1)与所述蛋白质GmSQLE1相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用；

E2)与所述蛋白质GmSQLE1相关的生物材料在制备调控植物抗逆性的产品中的应用；

E3)与所述蛋白质GmSQLE1相关的生物材料在培育抗逆植物中的应用；

E4)与所述蛋白质GmSQLE1相关的生物材料在制备培育抗逆植物的产品中的应用；

E5)与所述蛋白质GmSQLE1相关的生物材料在植物育种中的应用；

所述生物材料可为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码所述蛋白质GmSQLE1的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。

上述应用中，B1)所述核酸分子可为下述任一种：

C1)编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；

C2)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。

SEQ ID No.2所示的DNA分子(调控植物抗逆性的GmSQLE1基因)编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质GmSQLE1。

SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为蛋白质GmSQLE1编码基因(CDS)的核苷酸序列。本发明所述的蛋白质GmSQLE1基因(GmSQLE1基因)可以为任意能够编码蛋白质GmSQLE1的核苷酸序列。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

B1)所述核酸分子还可包括在SEQ ID No.2所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。

所述核酸分子还包括与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列一致性为95％以上且来源相同种属的核酸分子。

本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。

本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。具体可为Peasyblunt载体、载体pBI121和/或载体pTF101。

可用现有的植物表达载体构建含有GmSQLE1基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括但不限于如双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如包括但不限于农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮藏蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用GmSQLE1基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，包括但不限于如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子,包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入包括但不限于可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的GmSQLE1基因或基因的片段导入植物细胞或受体植物，可获得抗逆性提高的转基因细胞系及转基因植株。携带GmSQLE1基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织,并将转化的植物组织培育成植株。

本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产碱菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽孢杆菌属(Bacillus)等。具体可为大肠杆菌感受态细胞TOP10和/或根癌农杆菌GV3101。

所述重组载体具体可为重组载体Peasyblunt-GmSQLE1、pBI121-GmSQLE1和/或pTF101-GmSQLE1。

所述重组载体Peasyblunt-GmSQLE1是使用平端克隆的方法，将核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA片段连接在Peasyblunt载体上，保持Peasyblunt载体的其他序列不变，得到的重组载体。

所述重组载体pBI121-GmSQLE1是在载体pBI121的SmaI酶切位点插入了SEQ IDNo.2所示的DNA分子。

所述重组载体pTF101-GmSQLE1是在载体pTF101的XbaI酶切位点插入了SEQ IDNo.2所示的DNA分子。

所述重组微生物具体可为重组农杆菌GV3101/pBI121-GmSQLE1和/或GV3101/pTF101-GmSQLE1。

所述重组农杆菌GV3101/pBI121-GmSQLE1含有编码序列为SEQ ID NO.2的GmSQLE1基因，是将所述重组载体pBI121-GmSQLE1导入农杆菌GV3101得到的重组微生物。

所述重组农杆菌GV3101/pTF101-GmSQLE1含有编码序列为SEQ ID NO.2的GmSQLE1基因，是将所述重组载体pTF101-GmSQLE1导入农杆菌GV3101得到的重组微生物。本发明还提供了一种培育抗逆植物的方法，所述方法包括提高目的植物中所述蛋白质GmSQLE1的含量和/或活性，得到抗逆性高于所述目的植物的抗逆植物。

上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白质GmSQLE1的含量和/或活性通过提高目的植物中所述蛋白质GmSQLE1的编码基因的表达量实现。

上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白质GmSQLE1的编码基因的表达量通过将所述蛋白质GmSQLE1的编码基因导入所述目的植物实现。

上述方法中，所述蛋白质GmSQLE1的编码基因可为下述任一种：

F1)编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；

F2)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。

具体地，在本发明的一个实施方案中，所述提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量通过将SEQ ID No.2所示的DNA分子导入所述目的植物实现。

在本发明的一个实施方案中，所述培育抗逆植物的方法包括如下步骤：

(1)构建包含SEQ ID NO.2所示DNA分子的重组载体；

(2)将步骤(1)构建的重组载体转入目的植物(如作物或大豆)中；

(3)经筛选和鉴定获得抗逆性高于所述目的植物的抗逆植物。

上述方法中，所述植物可为G1)或G2)：

G1)单子叶植物或双子叶植物；

G2)豆科植物或十字花科植物。

本文中，所述植物可为作物(农作物)。

本发明还提供了所述蛋白质GmSQLE1，或所述生物材料，或所述核酸分子，或任一所述培育抗逆植物的方法在创制抗逆植物和/或植物育种中的应用。

本文所述蛋白质GmSQLE1、所述生物材料和所述核酸分子均在本发明的保护范围内。

本文所述蛋白质GmSQLE1可为大豆抗逆相关蛋白。

本文所述植物育种可为作物抗逆育种。

所述调控植物抗逆性可为提高植物抗逆性或降低植物抗逆性。

所述GmSQLE1蛋白或其编码基因在目的植物中的表达量和/或活性提高，植物的抗逆性提高。

进一步地，所述抗逆性提高表现在：

(1)提高目的植物的存活率；

(2)提高目的植物的叶绿素含量；

(3)提高目的植物的脯氨酸含量；

(4)降低目的植物的丙二醛含量。

所述抗逆性包括耐盐性、抗旱性、耐热性、耐寒性和/或耐强光性，但不限于此。

具体地，所述抗逆性具体可为耐盐性和/或抗旱性。

本发明中，所述抗逆植物理解为不仅包含将所述GmSQLE1基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述抗逆植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明通过将来源于大豆(Glycine max(Linn.)Merr.)的调控植物抗逆性的GmSQLE1基因分别导入到受体对照植物野生型拟南芥(WT，Col)和野生型大豆(Williams82)中，得到了转GmSQLE1基因的纯合的拟南芥株系(GmSQLE1-1株系、GmSQLE1-2株系和GmSQLE1-3株系)和纯合的大豆株系(GmSQLE1-OE1株系、GmSQLE1-OE2株系、GmSQLE1-OE3株系)。实验证明，与未转基因受体对照相比，在干旱胁迫和盐胁迫条件下，过表达GmSQLE1基因的转基因拟南芥和大豆的存活率均显著高于受体对照，长势也显著优于受体对照，表明GmSQLE1基因的过表达可以显著提高植物的抗干旱胁迫能力和耐盐能力(即提高了植物的抗逆性)，具体表现在过表达GmSQLE1基因的转基因拟南芥和大豆的存活率显著提高、叶绿素含量和脯氨酸含量显著增加，并且丙二醛含量显著降低，各项生理指标均显著优于受体对照。因此，在干旱胁迫和高盐胁迫条件下，过表达GmSQLE1基因的拟南芥和大豆均表现出了更强的耐受性，表明本发明的GmSQLE1蛋白及其编码基因GmSQLE1可以调控植物的抗逆性(如抗旱性和/或耐盐性)，通过提高目的植物中GmSQLE1蛋白质的含量和/或活性(如过表达GmSQLE1基因)可以显著提高目的植物的抗逆性。

本发明挖掘了在干旱胁迫和盐胁迫条件下能够调控植物抗逆性的新基因，对于培育植物的抗逆新品种、提高植物的抗逆性具有重要的意义和应用价值。

附图说明

图1为转GmSQLE1基因拟南芥抗逆性鉴定分析。图1中A为转基因拟南芥和野生型拟南芥(Col-0)在盐条件(Salt)下的表型图；图1中B为转基因拟南芥和野生型拟南芥(Col-0)在干旱条件(Drought)下的表型图；图1中C、D和E为转基因拟南芥和野生型拟南芥(Col-0)在盐条件(Salt)和干旱条件(Drought)下的脯氨酸(Pro)含量、丙二醛(MDA)含量和叶绿素(Chlorophyll)含量的测定结果图。

图2为转GmSQLE1基因大豆检测。图2中A为转基因大豆和受体对照野生型在正常条件下的表型；图2中B为转基因大豆的PCR检测；图2中C为转基因大豆中GmSQLE1目的基因的表达量分析；图2中D为正常生长条件下转基因大豆和野生型的总根长；图2中E为正常生长条件下转基因大豆和野生型的下胚轴长度；图2中F为正常生长条件下转基因大豆和野生型的鲜重。

图3为转GmSQLE1基因大豆在苗期的抗逆性鉴定。图3中A为幼苗时期的转基因大豆和受体对照在150mM NaCl和200mM甘露醇的固体培养基处理一周后表型图；图3中B-E为组培转基因大豆和受体对照的幼苗分别在150mM NaCl和200mM甘露醇的固体培养基处理一周后生物量的测量。图3中F为幼苗时期的转基因大豆和受体对照在土培干旱控水一周后(干旱胁迫处理)和盐胁迫处理后的表型图。图3中G-I为幼苗时期的转基因大豆和受体对照的幼苗在200mM NaCl的水溶液处理3天和干旱胁迫处理一周后的叶片脯氨酸、丙二醛及叶绿素含量的测定结果图。

图4为转GmSQLE1基因大豆在开花期的抗逆性鉴定。图4中A为幼苗在开花时期的转基因大豆和受体对照分别在控水和300mM NaCl处理一周后表型图。第一排为正常条件，第二排为干旱处理，第三排为盐胁迫处理；图4中B为幼苗在开花时期的转基因大豆和受体对照在控水处理一周后存活率的测量结果图；图4中C为幼苗在开花时期的转基因大豆和受体对照在300mM NaCl的水溶液处理一周后的生物量的测定结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的大豆品种“Williams 82”和“铁丰8号”记载在下述文献中：姜静涵.大豆苗期耐盐机理研究及耐盐基因定位[D].中国农业科学院,2013.，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

下述实施例中的野生型拟南芥(WT，Col)为哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)，购自SALK公司。

下述实施例中的根癌农杆菌GV3101购自北京拜尔迪生物技术公司。

下述实施例中的载体pTF101记载于如下文献中：Yu TF,Liu Y,Fu JD,Ma J,FangZW,Chen J,Zheng L,Lu ZW,Zhou YB,Chen M,Xu ZS and Ma YZ.(2021)The NF-Y-PYRmodule integrates the abscisic acid signal pathway to regulate plant stresstolerance.Plant Biotechnology Journal,(2021)19,pp.2589–2605.。

下述实施例中的载体pBI121购自拜尔迪公司。

下述实施例采用GraphPad Prism统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用Two-way ANOVA检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异。

实施例1、GmSQLE1蛋白及其编码基因的获得

正常条件下生长2周左右的铁丰8号四叶期幼苗NaCl处理2小时，用液氮速冻，-80℃保存备用。

采用Trizol法(TianGen)提取大豆叶片总RNA，用反转录酶XL(AMV)合成第一链cDNA。采用SMART法合成ds cDNA，PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。

通过5’RACE和3’RACE的方法获得SEQ ID No.2所示的DNA分子。SEQ ID No.2所示的DNA分子编码SEQ ID No.1所示的蛋白质。

将从大豆品种“铁丰8号”中分离克隆出的植物抗逆性相关蛋白基因命名为GmSQLE1基因。GmSQLE1基因的编码序列(CDS)是SEQ ID No.2，编码氨基酸序列是SEQ IDNo.1的蛋白质，命名为GmSQLE1蛋白。

实施例2、GmSQLE1蛋白对拟南芥抗逆性的影响

一、重组表达载体的构建

1、提取铁丰8号的叶片的总RNA，反转录得到cDNA。

2、用上述步骤1中的cDNA作为模板，用特异性的引物对大豆GmSQLE1基因进行扩增，并回收PCR产物。GmSQLE1基因的特异性扩增引物如下：

SQLE-F：5’-CAAAGAGGTGTTCCAAGAAACTAAA-3’，

SQLE-R：5’-GAGTTCCCTCTCTTATTCTTCTTGG-3’。

3、将上述扩增并回收的PCR产物与Peasyblunt载体连接(pEASY-Blunt CloningKit，目录号CB101，全式金，北京)，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，并涂布于含有50μg/L卡那霉素的固体LB培养基平板上，37℃过夜培养。对大肠杆菌的克隆菌落进行菌落PCR筛选，将阳性的克隆送入公司进行测序，将测序正确的菌落进行保存，提取质粒，得到序列正确的质粒命名为Peasyblunt-GmSQLE1。

Peasyblunt-GmSQLE1质粒是使用平端克隆的方法，将核苷酸序列是序列表中SEQID No.2的DNA片段连接在Peasyblunt载体上，保持Peasyblunt载体的其他序列不变，得到的重组载体。

4、以步骤3得到的质粒Peasyblunt-GmSQLE1为模板，采用GmSQLE1-121F和GmSQLE1-121R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，并进行PCR产物胶回收。

GmSQLE1-121F:5'-CTCTAGAGGATC

GmSQLE1-121R:5'-ACTAGTGGATCC

5、用限制性内切酶SmaI酶切载体pBI121，回收载体骨架。

6、将步骤4的PCR产物和步骤5的载体骨架利用In-Fusion(六合通，北京)技术进行连接，得到重组质粒pBI121-GmSQLE1。根据测序结果，对重组质粒pBI121-GmSQLE1进行结构描述如下：在载体pBI121的SmaI酶切位点插入了SEQ ID No.2所示的DNA分子。

二、转基因拟南芥的获得

1、将重组质粒pBI121-GmSQLE1导入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌GV3101/pBI121-GmSQLE1。

2、将步骤1得到的重组农杆菌GV3101/pBI121-GmSQLE1接种于液体YEP培养基，28℃、3000rpm振荡培养约30小时。

3、完成步骤2后，将菌液转至含50μg/L利福平和50μg/L卡那霉素的液体YEP培养基，28℃、300rpm振荡培养至OD

4、完成步骤3后，收集菌体,4℃、4000g离心10min，用含10％蔗糖和0.02％silwet的水溶液稀释至OD

5、将种植于花盆中的哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)倒扣在盛有侵染液的容器中，使花浸没50s左右，然后取出花盆，侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，24小时后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养，收获种子，即为T

6、将T

7、T

8、对T

GmSQLE1-JCF：5’-CCTTCGCCAATCTTATTCTA-3’，

GmSQLE1-JCR：5’-CAACAGCAAAGAAATGGAGAACCAA-3’。

PCR鉴定了三个纯合的转GmSQLE1基因拟南芥株系命名为：GmSQLE1-1株系，GmSQLE1-2株系和GmSQLE1-3株系。

三、拟南芥的抗逆性鉴定

1、干旱逆境胁迫处理(抗旱性鉴定)

待测种子为：GmSQLE1-1株系T

干旱组(Drought)：将待测种子播种，从种子萌发开始计天数，20天后开始进行干旱处理(即连续一周不浇水)，然后进行复水处理(即恢复正常浇水一周)，然后拍照并统计存活率；

正常组(Normal)：将待测种子播种，从种子萌发开始计天数，20天后继续正常浇水管理两周，然后拍照。

设置三次重复试验，每次重复试验中每种待测种子对10株植株进行观察统计。同时统计存活率并测定脯氨酸(Pro)含量、丙二醛(MDA)含量和叶绿素(Chlorophyll)含量等各项生理指标。

结果见图1。图1中Col-0表示野生型拟南芥；OE-1表示GmSQLE1-1株系的拟南芥；OE-2表示GmSQLE1-2株系的拟南芥；OE-3表示GmSQLE1-3株系的拟南芥。

正常条件下，GmSQLE1-1株系、GmSQLE1-2株系和GmSQLE1-3株系的拟南芥长势与野生型拟南芥无差异。

干旱处理一周后，出现萎蔫死亡的植株，GmSQLE1-1株系、GmSQLE1-2株系和GmSQLE1-3株系的拟南芥长势均显著优于野生型拟南芥。GmSQLE1-1株系、GmSQLE1-2株系和GmSQLE1-3株系的拟南芥的存活率显著高于野生型拟南芥。表明GmSQLE1基因的过表达可以显著提高植物的抗旱性。

此外，正常条件下，GmSQLE1-1株系、GmSQLE1-2株系和GmSQLE1-3株系的拟南芥与野生型拟南芥(Col-0)的叶绿素(Chlorophyll)含量没有显著差异，干旱处理后，过表达GmSQLE1基因的转基因株系(GmSQLE1-1株系、GmSQLE1-2株系和GmSQLE1-3株系)的拟南芥的叶绿素(Chlorophyll)含量均显著高于野生型拟南芥(Col-0)，这表明在干旱处理下，转GmSQLE1基因拟南芥相比于非转基因的野生型拟南芥(Col-0)表现出了更强的耐受性。

正常条件下，GmSQLE1-1株系、GmSQLE1-2株系和GmSQLE1-3株系的拟南芥与野生型拟南芥(Col-0)的脯氨酸(Pro)含量没有显著差异，干旱处理后，过表达GmSQLE1基因的转基因株系(GmSQLE1-1株系、GmSQLE1-2株系和GmSQLE1-3株系)的拟南芥的脯氨酸(Pro)含量均显著高于野生型拟南芥(Col-0)。脯氨酸作为重要的渗透调节物质，在维持细胞的渗透势，保护细胞和维持渗透平衡中发挥了重要的作用，脯氨酸含量能间接的反应出植物对抗逆境胁迫的能力，因此，干旱处理后，脯氨酸(Pro)含量的提高，表明GmSQLE1基因的过表达提高了转GmSQLE1基因拟南芥的抗干旱胁迫能力。

正常条件下，GmSQLE1-1株系、GmSQLE1-2株系和GmSQLE1-3株系的拟南芥与野生型拟南芥(Col-0)的丙二醛(MDA)含量没有显著差异，干旱处理后，过表达GmSQLE1基因的转基因株系(GmSQLE1-1株系、GmSQLE1-2株系和GmSQLE1-3株系)的拟南芥的丙二醛(MDA)含量均显著低于野生型拟南芥(Col-0)。丙二醛是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度，MDA的积累也会对膜和细胞造成一定的伤害。在植物抗性生理研究中MDA含量是一个常用指标，可通过MDA了解膜脂过氧化的程度。因此，干旱处理后，过表达GmSQLE1基因的拟南芥减少了MDA的积累，从而减轻了干旱胁迫对转基因拟南芥造成的氧化损伤，提高了转GmSQLE1基因拟南芥的抗干旱胁迫能力。

2、高盐逆境胁迫处理(耐盐性鉴定)

待测种子为：GmSQLE1-1株系T

盐胁迫组(Salt)：将待测种子播种，从种子萌发开始计天数，20天后开始进行盐胁迫处理(即用200mM NaCl水溶液浇水，并处理一周)，然后拍照并统计存活率；

正常组(Normal)：将待测种子播种，从种子萌发开始计天数，20天后继续正常浇水管理一周，然后拍照。

设置三次重复试验，每次重复试验中每种待测种子对10株植株进行观察统计。同时统计存活率并测定脯氨酸(Pro)含量、丙二醛(MDA)含量和叶绿素(Chlorophyll)含量等各项生理指标。

结果见图1。图1中Col-0表示野生型拟南芥；OE-1表示GmSQLE1-1株系的拟南芥；OE-2表示GmSQLE1-2株系的拟南芥；OE-3表示GmSQLE1-3株系的拟南芥。

正常条件下，GmSQLE1-1株系、GmSQLE1-2株系和GmSQLE1-3株系的拟南芥生长状况与野生型拟南芥的生长状况均无显著差异。

盐胁迫处理后，GmSQLE1-1株系、GmSQLE1-2株系和GmSQLE1-3株系的拟南芥长势均显著优于野生型拟南芥。GmSQLE1-1株系、GmSQLE1-2株系和GmSQLE1-3株系的拟南芥的存活率显著高于野生型拟南芥。表明GmSQLE1基因的过表达可以显著提高植物的耐盐性。

此外，正常条件下，GmSQLE1-1株系、GmSQLE1-2株系和GmSQLE1-3株系的拟南芥与野生型拟南芥(Col-0)的脯氨酸(Pro)含量、丙二醛(MDA)含量和叶绿素(Chlorophyll)含量没有显著差异，盐胁迫处理后，过表达GmSQLE1基因的转基因株系(GmSQLE1-1株系、GmSQLE1-2株系和GmSQLE1-3株系)的拟南芥的脯氨酸(Pro)含量和叶绿素(Chlorophyll)含量均显著高于野生型拟南芥(Col-0)，而丙二醛(MDA)含量均显著低于野生型拟南芥，这表明在盐胁迫处理下，转GmSQLE1基因拟南芥相比于非转基因的野生型拟南芥(Col-0)表现出了更强的耐受性；过表达GmSQLE1基因的拟南芥减少了MDA的积累、增加了脯氨酸含量，减轻了盐胁迫对转基因拟南芥造成的氧化损伤，从而提高了转GmSQLE1基因拟南芥的耐盐性。

综上，GmSQLE1蛋白及其编码基因GmSQLE1可以调控植物的抗逆性(如抗旱性和/或耐盐性)，提高目的植物中GmSQLE1蛋白质的含量和/或活性(如过表达GmSQLE1基因)可以显著提高目的植物的抗逆性。

上述拟南芥的抗逆性鉴定步骤中，脯氨酸(Pro)含量、丙二醛(MDA)含量和叶绿素(Chlorophyll)含量的测定方法如下：

(1)叶绿素含量测定：称取0.1g拟南芥叶片，将其剪碎成大约1mm的碎片，放于含有20mL 95％的乙醇(80％的丙酮)溶液中，室温黑暗浸泡36-48h。将提取液过滤到50mL棕色容量瓶中，用95％的乙醇(80％丙酮)定容至50mL，摇匀，置于暗处备用待测。取1cm的比色皿，注入上述叶绿素酒精溶液，用95％乙醇为参比液，1cm烦人比色皿为吸水池，分别在663nm和645nm波长测吸光度，每一波长读三次数，取平均值带入公式计算。公式：叶绿素a含量(Ca)＝12.7A

(2)脯氨酸含量测定：按照脯氨酸含量检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)说明书操作测定脯氨酸含量。

(3)丙二醛含量测定：按照丙二醛(MDA)含量检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)说明书操作测定丙二醛含量。

实施例3、GmSQLE1蛋白对大豆抗逆性的影响

一、重组表达载体的构建

1、以实施例2步骤3中得到的质粒(Peasyblunt-GmSQLE1)为模板，采用GmSQLE1-101F和GmSQLE1-101R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，并进行PCR产物胶回收。

GmSQLE1-101F:5'-GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGGATTATCCGTAC-3'；

GmSQLE1-101R:5'-GCCCTTGCTCACCATTCTAGAATGGACAGGAGG-3。

2、用限制性内切酶XbaI酶切载体pTF101，回收载体骨架。

3、将步骤1的PCR回收产物和步骤2的载体骨架利用In-Fusion技术进行连接，得到重组质粒pTF101-GmSQLE1。经公司测序正确后，提取阳性菌液质粒备用。

重组质粒pTF101-GmSQLE1是在载体pTF101的XbaI酶切位点插入了SEQ ID No.2所示的DNA分子。

二、转基因大豆的获得

1、将重组质粒pTF101-GmSQLE1导入农杆菌GV3101，得到含有重组质粒的农杆菌GV3101/pTF101-GmSQLE1。

(1)将含有重组质粒的农杆菌GV3101/pTF101-GmSQLE1接种于YEP液体培养基中，28℃、3000rpm培养约18小时。

(2)将步骤(1)获得的菌液画线与YEP固体培养基(含50μg/L链霉素及50μg/L卡那)中，28℃培养约2天。

2、将大豆种子(Williams 82)经氯气消毒8小时，然后均匀播种于灭菌的B5培养基内，培养至胚根形成。

3、完成步骤2后，然后将大豆子叶以及子叶节以下的胚根切除，然后培养至大豆愈伤组织长出，用含有重组载体的农杆菌GV3101(GV3101/pTF101-GmSQLE1)侵染愈伤组织，经过培养后得到转GmSQLE1基因大豆(T

4、收获大豆种子筛选纯合株系：提取植株的RNA，反转录为cDNA，PCR的方法验证转基因阳性植株(含有编码序列为SEQ ID NO.2的GmSQLE1基因)，在第三代中筛选到完全能正常生长的稳定转化的纯合株系，分别命名为：GmSQLE1-OE1株系、GmSQLE1-OE2株系、GmSQLE1-OE3株系。

三、检测GmSQLE1基因的相对表达量

完成步骤二或步骤三后，取大豆叶片，提取总RNA并反转录得到cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR，采用Actin基因作为内参基因，检测GmSQLE1基因的相对表达量。

用于检测GmSQLE1基因的引物如下：

GmSQLE1ygdl-F：5’-GCAAAGAAGGTCACAGATTCAAGTT-3’，

GmSQLE1ygdl-R：5’-CGTCCATCCTTTCCAAGAGTGT-3’。

用于检测Actin基因的引物如下：

Actin-F：5’-CTGTTGGAAGGTGCTGAG-3’，

Actin-R：5’-ACATTGTTCTTAGTGGTGGCT-3’。

转GmSQLE1基因大豆的鉴定及GmSQLE1基因的相对表达量、总根长(Total rootlength)、子叶下轴长(Hypocotyl length)、植株鲜重(The fresh weight)的测定结果见图2。图2中WT表示野生型大豆；OE1表示GmSQLE1-OE1株系的大豆；OE2表示GmSQLE1-OE2株系的大豆；OE3表示GmSQLE1-OE3株系的大豆。vector表示转基因大豆检测的阳性对照。

结果表明，转GmSQLE1基因大豆中GmSQLE1基因的表达量是野生型(受体对照)大豆的5-17倍，差异具有显著性。外源基因GmSQLE1基因不但已顺利整合到大豆的基因组上，而且能够在转基因大豆中正常转录表达。

四、大豆的抗逆性鉴定

1、转基因大豆苗期抗逆性鉴定

分别鉴定了转GmSQLE1基因大豆在苗期的组培和土培条件下的抗干旱性和耐盐性。

待测株系为：步骤二得到的五周大的转GmSQLE1基因大豆株系(GmSQLE1-OE1株系、GmSQLE1-OE2株系和GmSQLE1-OE3株系的大豆)和野生型大豆(WT，Williams 82)。

150mM NaCl组(150mM NaCl)：将待测株系的种子播种于含有150mM NaCl的B5培养基中培养1周，测量下胚轴长度和整个植株鲜重。

200mM甘露醇组(200mM Mannitol)：将待测株系的种子播种于含有200mM甘露醇的B5培养基中培养1周，测量下胚轴长度和整个植株鲜重。

150mM NaCl组和200mM甘露醇组，除了培养基不同外，其它实验条件均相同。试验设三次重复，每次重复试验中每种待测株系20粒种子。

干旱胁迫组(Drought)：待测株系进行控水处理(具体处理方法，称取相同质量的土，播种于相同粒数的转基因大豆和受体对照。待幼苗生长至四叶期后，进行控水处理，即连续一周不浇水，然后进行复水处理(即恢复正常浇水一周)，观察其表型，控水5天后测量10株地上部分的鲜重，叶片丙二醛、脯氨酸及叶绿素含量。

正常组(Normal)：称取相同质量的土，播种于相同粒数的转基因大豆和受体对照。待幼苗生长至四叶期后，用水浇灌1次，浇灌1次一周后观察其表型，测量地上部分的鲜重，叶片丙二醛、脯氨酸及叶绿素含量。

盐胁迫组(Salt，200mM NaCl)：称取相同质量的土，播种于相同粒数的转基因大豆和受体对照。待幼苗生长至四叶期后，用200mM NaCl水溶液进行浇灌1次，浇灌1次一周后观察其表型，测量地上部分的鲜重，叶片丙二醛、脯氨酸及叶绿素含量。

干旱胁迫组、正常组和盐胁迫组除了浇灌不同外，其它实验条件均相同。设置三次重复试验，每次重复试验中每种待测株系对15株植株进行表型观察统计。同时测定叶片脯氨酸(Pro)含量、丙二醛(MDA)含量和叶绿素(Chlorophyll)含量等各项生理指标。

样品叶绿素含量的测定：分别取相同质量同时期对应的处理的与不处理的转基因与对照组大豆的叶片个0.2g(每个样本3个重复，200mM NaCl处理3天和25％PEG胁迫处理一周后的叶片)，将其剪成1cm左右的小长条放于相对应的10mL的离心管中，并分别向离心管中加入5mL 80％的丙酮，室温黑暗过夜静置。用酶标仪测量叶绿素的含量。

样品脯氨酸和丙二醛的测定方法依据试剂盒的具体操作步骤进行操作：丙二醛(MDA)含量检测试剂盒及脯氨酸含量检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，北京)。

结果如图3所示，图3中WT表示受体对照野生型大豆；OE1表示GmSQLE1-OE1株系的大豆；OE2表示GmSQLE1-OE2株系的大豆；OE3表示GmSQLE1-OE3株系的大豆。其中：

图3中A为幼苗时期的转基因大豆和受体对照分别在150mM NaCl和200mM甘露醇的固体培养基处理一周后表型照片(图3中A)。

图3中F为幼苗时期的转基因大豆和受体对照分别在200mM NaCl浇灌处理及土培干旱控水一周后的表型照片(图3中F)。

图3中B-E为组培转基因大豆和受体对照的幼苗分别在150mM NaCl和200mM甘露醇的固体培养基处理一周后，生物量的测量)。

图3中G-I为幼苗时期的转基因大豆和受体对照的幼苗在200mM NaCl的水溶液处理3天和干旱胁迫处理一周后的叶片丙二醛，脯氨酸及叶绿素含量的测定。

结果表明，盐处理一周和干旱处理一周后，受体对照出现严重的萎蔫，然而转GmSQLE1基因大豆植株的长势显著优于对照，其在干旱及高盐处理下的各项生理指标要显著优于受体对照。以上结果进一步表明GmSQLE1基因的过表达可以显著提高植物的抗旱性和耐盐性。

2、转基因大豆开花期抗逆性鉴定

为进一步验证在土壤栽培下过表达GmSQLE1基因能否提高转基因大豆的抗逆性，鉴定了转GmSQLE1基因大豆在土培条件下开花期的抗干旱性和耐盐性。

待测植株株系为：步骤二得到的五周大的转GmSQLE1基因大豆植株(GmSQLE1-OE1株系、GmSQLE1-OE2株系和GmSQLE1-OE3株系的大豆)、野生型大豆(WT，Williams 82)。

待测植株进行控水处理(干旱处理)和NaCl处理(盐胁迫处理)(具体处理方法：称取相同质量的土，播种于相同粒数的转基因大豆和受体对照。待幼苗生长至开花期后，分别进行正常处理、控水处理(干旱处理-每个株系10株，停止浇水2周后，恢复浇水一周后观察其表型并统计存活率)和300mM NaCl处理(盐胁迫处理)。处理一周后观察其表型)。三种处理，除了浇灌不同外，其它实验条件均相同。试验设三次重复，每次重复试验中每种待测株系15粒种子。

干旱处理(控水处理)：连续2周不浇水，然后进行复水处理(即恢复正常浇水一周)，然后拍照并统计存活率。

盐胁迫处理(Salt)：用300mM NaCl的水溶液进行浇灌1次，浇灌1次一周后观察其表型，测量地上部分的鲜重。

正常处理(Normal)：用水进行浇灌1次，浇灌1次一周后观察其表型，测量地上部分的鲜重。

设置三次重复试验，每次重复试验中每种待测株系对10株植株进行表型观察统计。同时统计存活率和测定生物量。

结果如图4所示，图4中WT表示受体对照野生型大豆；OE1表示GmSQLE1-OE1株系的大豆；OE2表示GmSQLE1-OE2株系的大豆；OE3表示GmSQLE1-OE3株系的大豆。其中：

图4中A为幼苗在开花时期的转基因大豆和受体对照分别在控水和300mM NaCl处理一周后表型照片。第一排为正常条件，第二排为干旱处理，第三排为盐胁迫处理。

图4中B为幼苗在开花时期的转基因大豆和受体对照在控水处理一周后，存活率的测量。

图4中C为幼苗在开花时期的转基因大豆和受体对照在300mM NaCl的水溶液处理一周后的生物量的测定。

结果表明，盐胁迫处理一周和干旱处理一周后，受体对照出现严重的萎蔫，转GmSQLE1基因大豆植株的长势要优于对照，其在干旱处理后的存活率显著高于受体对照，在高盐处理下的生理指标也显著优于受体对照。

因此，无论是过表达GmSQLE1基因的大豆还是过表达GmSQLE1基因的拟南芥的实验结果均表明，本发明的GmSQLE1蛋白及其编码基因GmSQLE1可以调控植物的抗逆性(如抗旱性和/或耐盐性)，通过提高目的植物中GmSQLE1蛋白质的含量和/或活性(如过表达GmSQLE1基因)可以显著提高目的植物的抗逆性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 大豆抗逆相关蛋白GmSQLE1及其编码基因在调控植物抗逆性中的应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 525

<212> PRT

<213> 大豆（Glycine max）

<400> 1

Met Asp Tyr Pro Tyr Ile Leu Gly Gly Ile Met Ala Cys Ser Phe Ala

1               5                   10                  15

Phe Leu Tyr Val Val Tyr Ser Phe Gly Ala Lys Lys Val Thr Asp Ser

            20                  25                  30

Ser Ser Ile His Val Lys Ser Asn Glu Cys Ala Lys Thr Ser Ser Glu

        35                  40                  45

Gly Gly Ile Cys Ser Ser Asp Glu Asp Ala Gly Ser Ala Asp Ile Ile

    50                  55                  60

Ile Val Gly Ala Gly Val Ala Gly Ala Ala Leu Ala Tyr Thr Leu Gly

65                  70                  75                  80

Lys Asp Gly Arg Arg Val His Val Ile Glu Arg Asp Leu Ser Glu Pro

                85                  90                  95

Asp Arg Ile Val Gly Glu Leu Leu Gln Pro Gly Gly Tyr Leu Arg Leu

            100                 105                 110

Ile Glu Leu Gly Leu Gln Asp Cys Val Asp Glu Ile Asp Ser Gln Gln

        115                 120                 125

Val Phe Gly Tyr Ala Leu Tyr Met Asp Gly Lys Asn Thr Lys Leu Ser

    130                 135                 140

Tyr Pro Leu Glu Lys Phe Ser Ser Asp Ile Ser Gly Arg Ser Phe His

145                 150                 155                 160

Asn Gly Arg Phe Ile Gln Arg Met Arg Glu Lys Ala Ser Ser Leu Pro

                165                 170                 175

Asn Val Lys Leu Glu Gln Gly Thr Val Thr Ser Leu Leu Glu Glu Lys

            180                 185                 190

Gly Thr Ile Thr Gly Val His Tyr Lys Ile Lys Ser Gly Gln Glu Phe

        195                 200                 205

Thr Ala Lys Ala Pro Leu Thr Ile Val Cys Asp Gly Cys Phe Ser Asn

    210                 215                 220

Leu Arg Arg Ser Leu Cys Asn Pro Lys Val Asp Val Pro Ser His Phe

225                 230                 235                 240

Val Gly Leu Val Leu Glu Asn Cys Asn Leu Pro Tyr Ala Asn His Gly

                245                 250                 255

His Val Ile Leu Gly Asp Pro Ser Pro Val Leu Phe Tyr Pro Ile Ser

            260                 265                 270

Ser Thr Glu Ile Arg Cys Leu Val Asp Val Pro Gly Gln Lys Leu Pro

        275                 280                 285

Ser Leu Gly Gly Gly Glu Met Ala Cys Tyr Leu Lys Thr Val Val Ala

    290                 295                 300

Pro Gln Val Pro Pro Glu Leu Tyr Asp Ser Phe Ile Ala Ala Ile Asp

305                 310                 315                 320

Lys Gly Asn Ile Arg Thr Met Pro Asn Arg Ser Met Pro Ala Ser Pro

                325                 330                 335

Tyr Pro Thr Pro Gly Ala Leu Leu Met Gly Asp Ala Phe Asn Met Arg

            340                 345                 350

His Pro Leu Thr Gly Gly Gly Met Thr Val Ala Leu Ser Asp Ile Val

        355                 360                 365

Val Leu Arg Asp Leu Leu Lys Pro Leu His Asp Leu His Asp Ala Ser

    370                 375                 380

Ala Leu Cys Arg Tyr Leu Glu Ser Phe Tyr Thr Leu Arg Lys Pro Val

385                 390                 395                 400

Ala Ser Thr Ile Asn Thr Leu Ala Gly Ala Leu Tyr Lys Val Phe Cys

                405                 410                 415

Ala Ser Pro Asp Pro Ala Arg Lys Glu Met Arg Gln Ala Cys Phe Asp

            420                 425                 430

Tyr Leu Ser Leu Gly Gly Val Phe Ser Asp Gly Pro Ile Ala Leu Leu

        435                 440                 445

Ser Gly Leu Asn Pro Arg Pro Leu Ser Leu Val Leu His Phe Phe Ala

    450                 455                 460

Val Ala Ile Tyr Gly Val Gly Arg Leu Leu Ile Pro Phe Pro Ser Pro

465                 470                 475                 480

Lys Arg Met Trp Ile Gly Ala Arg Leu Ile Ser Gly Ala Ser Gly Ile

                485                 490                 495

Ile Phe Pro Ile Ile Lys Ala Glu Gly Val Arg Gln Met Phe Phe Pro

            500                 505                 510

Ala Thr Val Pro Ala Tyr Tyr Arg Thr Pro Pro Val His

        515                 520                 525

<210> 2

<211> 1578

<212> DNA

<213> 大豆（Glycine max）

<400> 2

atggattatc cgtacattct aggagggatc atggcttgta gttttgcatt tttgtatgtt 60

gtgtacagtt ttggagcaaa gaaggtcaca gattcaagtt caatacatgt aaagagtaat 120

gagtgtgcaa agacatcatc agaaggtgga atatgttctt cagatgagga tgcaggaagt 180

gctgacatca tcattgtggg tgctggggtt gctggtgcag ctcttgctta cactcttgga 240

aaggatggac ggcgagtgca tgtaattgaa agggatttga gtgaacctga caggatcgtg 300

ggtgaattgc tacaacctgg gggctatctg aggttaattg agttgggcct tcaggattgt 360

gtggatgaaa ttgattcaca gcaagtcttt ggctatgctc tgtatatgga tggcaaaaat 420

accaagctgt cttatccttt ggaaaaattc agctctgata tttctgggag aagctttcac 480

aatggccgtt tcatacagag aatgcgagaa aaggcttcgt ctcttccaaa tgtaaaatta 540

gaacaaggaa ctgtcacatc tctacttgaa gagaaaggaa ccatcactgg ggtgcactac 600

aaaatcaaaa gtggacaaga gttcacagca aaggctcccc tcaccatagt atgtgatggt 660

tgtttttcca acttgaggcg ttctctttgc aatcctaagg ttgacgttcc ctctcatttt 720

gttggtctgg tcttggagaa ttgtaatctt ccatatgcaa atcatggtca cgtcatctta 780

ggtgatcctt cacccgtttt gttttatccc atcagtagca ctgagattcg ctgtttggtt 840

gatgtgcccg gccaaaaatt accttcccta ggtggtggtg aaatggcctg ttatttgaaa 900

actgtggtgg ctcctcaggt tcctccagag ctgtatgatt cttttatagc agctattgac 960

aaaggaaaca taagaaccat gccaaataga agcatgcctg cctcacctta tcccacacca 1020

ggtgcacttc taatgggaga cgccttcaat atgcgtcacc ctttaactgg aggaggaatg 1080

actgtggctt tatctgacat tgttgtgcta agggatttac ttaaacctct tcatgatctg 1140

catgatgctt ctgctctttg cagatacctt gaatcattct acaccctacg caagccagtg 1200

gcatctacaa taaacacact agctggggca ttgtacaagg tcttttgtgc atctcctgat 1260

ccagctagaa aggaaatgcg ccaagcatgt ttcgattact tgagccttgg aggtgttttc 1320

tcagatggac caatagctct actctctggt ctaaatcctc gtccattgag tttggttctc 1380

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