一种鉴定千年桐植株性别的InDel标记、引物及它们的应用

摘要

本发明公开了一种鉴定千年桐植株性别的InDel标记、引物及它们的应用。使用所述引物可以使用千年桐除种子外的任何组织对其进行性别筛选，该标记对雄株的鉴定准确度为100％，对雌株的鉴定准确度为96％，综合鉴定准确度为98％，具有操作简单、样品量少、灵敏度高、分离速度快、成本低且检测准确度高等优点，市场参考价值高。本发明为通过InDel分子标记辅助筛选千年桐雌/雄性材料提供了一种准确、简捷且快速的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种鉴定千年桐植株性别性状的InDel标记、引物及其应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

千年桐(Vernicia montana Lour.)是一种具有很高经济价值和观赏价值的木本油料树种，其主要经济产品为种子中提取出的桐油。桐油具有干燥快、比重轻、光泽度好、绝缘、抗寒抗热、耐酸碱及防腐防锈等优良特性，被广泛的用于生产优质安全的防水涂料、电子元件中的绝缘层、环保印刷油墨及生物柴油等，具有较高的开发利用价值。千年桐若以产果为主要目标，那么配置合适比例的雌、雄株才能达到最佳的经济效益；若作为景观栽植，雄株更为美观。但千年桐为雌雄异株植物，童期较长，需要生长3～4年才能开花。在定向育种过程中，目前植株的性别需要通过发育成熟的花器官来判别，所需时间长，且成年树树体高大，对于判别性别后不需要的个体又存在拔除困难、耗费劳力等问题，因此开发千年桐性别特异的分子标记，用于苗期性别的准确、快速鉴定，对于缩短千年桐育种周期、提高育种效率、节约育种成本具有重要意义。

InDel(Insertion/Deletion polymorphisms，插入/缺失多态性)标记是基于全基因组DNA序列的新一代分子标记之一，是基于不同个体的基因组同源序列发生的不同大小的小片段核苷酸(至少1bp)的插入与缺失。InDel标记具有数量多、分布广和变异类型丰富等优点，使用InDel标记对物种进行基因分型具有较好的稳定性和多态性等优点，在性别鉴定方面具有重要的应用潜力。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明的目的是提供一种鉴定千年桐植株性别性状的InDel标记及其引物，以及该InDel标记引物在鉴定其雌/雄性别上的应用，使用所述引物可以使用千年桐除种子外的任何组织对其进行性别筛选，具有准确率高、重复性好、鉴别速度快等优点，为通过InDel分子标记辅助筛选千年桐雌/雄性材料提供了一种准确、简捷且快速的方法。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

一种鉴定千年桐植株性别的InDel标记，该InDel位点位于千年桐雄株基因组2号染色体102 799 917bp到102 799 933bp处，千年桐雌株材料在该InDel位点的基因型为杂合型ID，而雄株材料在该InDel位点的基因型为插入纯合型II。

所述的鉴定千年桐植株性别的InDel标记，利用正向引物BASS4-F：CAAATTACCAGAATAGTATGCC和反向引物BASS4-R：GACCTCTAACAATGTTTTCAAC扩增。

所述的鉴定千年桐植株性别的InDel标记，用荧光标记毛细管电泳检测扩增产物，若电泳图谱中有两个峰，且峰图显示的基因型为249bp和253bp，则该InDel位点的基因型为杂合型ID；若只有一个峰且峰图显示的基因型为253bp，则该InDel位点基因型为插入纯合型II。

所述的鉴定千年桐植株性别的InDel标记，所述正向引物的5’末端采用荧光基团修饰。

所述的鉴定千年桐植株性别的InDel标记，所述的引物对浓度为10μM。

所述的鉴定千年桐植株性别的InDel标记，所述基因组DNA浓度为50～100ng/μL。

本发明还提供了一种鉴定千年桐植株性别的InDel标记引物，

正向引物BASS4-F：CAAATTACCAGAATAGTATGCC，SEQ ID NO.1；

反向引物BASS4-R：GACCTCTAACAATGTTTTCAAC，SEQ ID NO.2。

本发明还提供了所述的鉴定千年桐植株性别的InDel标记，或者所述的鉴定千年桐植株性别的InDel标记引物的应用，用于鉴定千年桐植株性别。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供的InDel位点基因型分型的方法，通过基于25个千年桐雌株和25个千年桐雄株个体进行基因组重测序，利用性别性状基于混合线性模型进行全基因组关联分析获得性别显著相关的InDel位点。根据筛选出的InDel位点设计PCR扩增引物，包括正向引物和反向引物，其中正向引物5’末端采用荧光基团修饰。然后对待测样本基因组DNA进行PCR扩增以获得扩增产物，用荧光标记毛细管电泳检测扩增产物，确定待测样本中InDel位点的基因型。鉴定标准为：当毛细管电泳图谱中有两个峰，且峰图显示的基因型为249/253，则待测千年桐为雌株；当毛细管电泳图谱中只有一个峰，且峰图显示的基因型为253，则待测千年桐为雄株。

(2)本发明通过上述引物对，成功筛选到一个与千年桐性别紧密关联的InDel分子标记，通过分别随机选取50株雌、雄材料进行验证，该标记对雄株的鉴定准确度为100％，对雌株的鉴定准确度为96％，综合鉴定准确度为98％，具有操作简单、样品量少、灵敏度高、分离速度快、成本低且检测准确度高等优点，市场参考价值高。

附图说明

图1为本发明前期178个测序个体的系统进化关系及群体结构分析；

图1a为系统进化关系；

图1b为交叉验证误差值最低时每个植株的群体结构，其中每一种颜色代表一个祖先组分；

图1c标示的是用于GWAS分析的样品，其中粉色三角标示的为选取的雌株样品，蓝色三角标示的为选取的雄株样品。

图2为本发明初期筛选出的18个极显著的InDels，即图1中红色虚线以上的点。

图3为本发明实施例1中荧光标记毛细管电泳图谱。

具体实施方式

本发明提供了一种利用一个InDel位点基因分型来鉴定千年桐植株性别的方法，其位点筛选和应用包括以下步骤：(1)对千年桐雌、雄个体分别进行全基因组重测序并鉴定出变异位点；(2)以性别作为性状开展基于InDel的全基因组关联分析，筛选出与性别显著相关的InDels；(3)根据筛选出的InDel位点设计PCR扩增引物，包括正向引物和反向引物，其中正向引物5’末端采用荧光基团修饰；(4)利用所述PCR扩增引物对待测样本DNA进行扩增，获得的扩增产物利用荧光标记毛细管电泳进行检测，利用GeneMapper软件进行图像收集和扩增大小分析；若毛细管电泳图谱中有两个峰，且峰图显示的片段长度为249bp/253bp，则待测千年桐为雌株，其基因型为杂合型ID；若毛细管电泳图谱中只有一个峰，且峰图显示的片段长度为253bp，则待测千年桐为雄株，其基因型为杂合型II。

本发明中所述待测样本基因组DNA采用常规的植物基因组DNA提取方法获得，具体在本发明实施例中采用试剂盒法提取DNA，具体使用的是Qiagen DNeasy Plant Pro Kit；所述基因组DNA浓度优选地为50～100ng/μL。

实施例1

本实施例筛选与千年桐性别连锁的InDel分子标记，并利用该InDel分子标记进行千年桐植株的性别鉴定，包括以下步骤：

(1)根据表型对千年桐植株的性别进行鉴定及叶片采集：

本发明供试材料为分布于湖南、湖北、广西、云南、广东、浙江、四川等地的成年千年桐，具有不同的遗传背景。其性别调查于3-5月花期进行，整株开雌花的鉴定为雌株，整株开雄花或绝大多数花为雄花的鉴定为雄株。共采集了88株雄株和90株雌株的嫩叶，硅胶干燥保存，用于基因组DNA提取。

(2)基因组DNA提取(试剂盒法，Qiagen DNeasy Plant Pro Kit)。

①称取50mg干燥叶片于2mL离心管中，用液氮充分研磨，加入500μL CD1溶液，短暂涡旋混匀。

②涡旋仪最大转速剧烈震荡10min。

③室温条件下，12 000x g离心2min。吸取上清液并转移至新的1.5mL离心管中，加入200μL CD2溶液，涡旋5s混匀。

④室温下，12 000x g离心1min。吸取上清液并转移至新的1.5mL离心管中，加入500μL的APP缓冲液，涡旋5s混匀。

⑤将上述裂解产物转移到MB旋转柱上。12 000x g离心1min。

⑥将MB旋转柱放入干净的2mL收集管中。向MB旋转柱中加入650μL的AW1缓冲液。12000x g离心1min，去废液，MB旋转柱放回收集管。

⑦MB旋转柱中加入650μL的AW2缓冲液。12 000x g离心1min，去废液，MB旋转柱放回收集管。

⑧16 000x g离心2min。将MB旋转柱放入新的1.5mL洗脱管中。

⑨将50μL EB缓冲液加入到MB旋转柱的滤膜中心。

⑩12 000x g离心1min收集基因组DNA。

(3)确定千年桐性别连锁的InDel。

本发明利用Illumina Novaseq 6000测序平台对178株(88株雄株和90株雌株)千年桐进行全基因重测序，测序深度为约10×(按照基因大小为1.3Gb的标准计算)。利用本课题组自测千年桐雄株参考基因组作为参考，对其进行变异检测，过滤后获得38 359 821个高质量SNP和4 266 202个高质量InDel，利用位于单拷贝基因中的SNP采用邻接法进行进化树的构建和采用最大似然估计分析群体结构(图1)。根据分析结果分别挑选出遗传背景相差较大的雌、雄株各25株(图1c)进行基于InDels的全基因组关联(GWAS)分析。使用VCFtools软件提取样本的InDel信息，以性别作为性状，使用基于混合线性模型的GEMMA软件进行GWAS分析，使用Wald方法进行P值检测，显著性阈值筛选使用Genetic Type I errorcalculator，总共筛选出18个极显著的InDels(图2)，其中有4个长度差异大于2bp的InDels，分别为InDel1，InDel2，InDel3，InDel4；所述InDel1位于2号染色体102 799 917bp到102 799 933bp处，所述InDel2位于2号染色体102 806 294bp到102 806 337bp处，所述InDel3位于2号染色体102 813 678bp到102 813 682bp处，所述InDel4位于2号染色体102816 555处。

(4)使用荧光标记毛细管电泳进行基因分型验证。

本发明利用记录InDel信息的VCF文件，结合参考基因组信息，截取上述InDel位点上下游各300bp的序列，利用SnapGene根据截取的序列设计引物，包括正向引物和反向引物，设计好的引物于生工生物工程(上海)股份有限公司进行引物合成，正向引物5’末端使用FAM荧光基团进行修饰。优选地根据InDel1设计的引物为正向引物SEQ ID NO.1和反向引物SEQ ID NO.2；优选地根据InDel2设计的引物为正向引物SEQ ID NO.3和反向引物SEQ IDNO.4；优选地根据InDel3设计的引物为正向引物SEQ ID NO.5和反向引物SEQ ID NO.6；优选地根据InDel4设计的引物为正向引物SEQ ID NO.7和反向引物SEQ ID NO.8。

SEQ ID NO.1：CAAATTACCAGAATAGTATGCC；

SEQ ID NO.2：GACCTCTAACAATGTTTTCAAC；

SEQ ID NO.3：GGAAACTACTGCAGAGTC；

SEQ ID NO.4：CAATGACAACAAGTTCTCC；

SEQ ID NO.5：TGTGGCTGATTCGAAATC；

SEQ ID NO.6：CAACTTTCATACTCCCTTTG；

SEQ ID NO.7：TCAATCTTAGCCAACAGC；

SEQ ID NO.8：GCTAGAGTGTAGCTTCAT；

随机挑选50棵雌株和50棵雄株，使用设计的引物对分别对其基因组DNA进行PCR扩增。扩增反应程序为预变性94℃1min；变性98℃10sec，退火55℃15sec，延伸68℃30sec，35个循环；最后终延伸68℃5min；于4℃避光保存。将PCR扩增产物进行荧光标记毛细管电泳检测，每条泳道检测一株个体，分子量内标使用LIZ500，利用GeneMapper软件分析扩增产物的片段大小，片段大小的误差为0～1bp，根据检测结果确定检测个体的基因型。最终筛选出一对较为稳定且基因分型效果好的引物对，利用该InDel分子标记可以鉴定千年桐的植株性别。该InDel分子标记为上述InDel1，位于千年桐雄株基因组2号染色体102 799917bp到102799 933bp处，鉴定该InDel位点的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。

SEQ ID NO.1：CAAATTACCAGAATAGTATGCC；

SEQ ID NO.2：GACCTCTAACAATGTTTTCAAC。

荧光标记毛细管电泳结果峰图如图3所示，使用引物SEQ ID NO.1～2对千年桐雌、雄株的基因组DNA进行PCR扩增，雄株的扩增产物为单峰，且峰图显示的片段长度为253bp，其基因型为杂合型II；雌株的扩增产物为双峰，且峰图显示的片段长度为249bp/253bp，其基因型为杂合型ID。检测结果显示，有50株雄株和2株雌株基因型为II，48株雌株基因型为ID。雄株的鉴定准确度为100％，对雌株的鉴定准确度为96％，综合鉴定准确度为98％。

综上，本实施例成功筛选出一个与千年桐性别紧密相关的InDel分子标记，以及一对可以扩增上述InDel分子标记的引物对，可应用于千年桐幼苗植株性别鉴定，提高其栽培利用效率。