包含枣皮树果实提取物作为有效成分的用于预防和治疗良性前列腺增生症的组合物

摘要

本发明涉及包含枣皮树果实提取物作为有效成分的用于预防或治疗良性前列腺增生症的组合物。本发明的枣皮树果实提取物在体外(in vitro)抑制5α‑还原酶2、前列腺特异性抗原(PSA)以及5α‑还原酶2的生成，并且，在睾丸素诱导的良性前列腺增生症大鼠模型中，抑制前列腺组织肥大、5α‑还原酶以及前列腺特异性抗原(PSA)的含量，从而即使在动物模型中也有助于表现出对良性前列腺增生症的优异的预防或抑制效果，因此，具有产业上的可利用性。

说明书

【技术领域】

本发明涉及包含枣皮树果实提取物作为有效成分的用于预防和治疗良性前列腺增生症的组合物。更具体地，涉及利用作为天然原料的枣皮树(Elaeagnus multrifloraThunb.)果实，可以安全使用而无毒副作用的用于预防和治疗良性前列腺增生症的药物组合物。

【背景技术】

作为前列腺疾病之一，良性前列腺增生症(Benign prostatic hyperplasia，BPH)是由于各种原因导致尿道周围的前列腺体积增大，因而压迫尿道，从而引起尿液排出量减少等症状的疾病。

最近，上述良性前列腺增生症被定义为下部尿路症状的主诉，其统称表现出膀胱排出障碍症状，例如男性中出现的尿频(8次以上/天)、夜尿、遗尿(强烈而突然的排尿愿望)、尿急(憋尿困难)、尿延迟(排尿延迟)、尿中断(尿流中断)以及排尿时需用力的现象等。众所周知，导致前列腺肥大的原因与作为雄性激素的睾丸素(testosterone)和二氢睾酮(dihydrotestosterone，DHT)有关。

良性前列腺增生症的药物治疗剂大致分为α受体阻滞剂和雄激素抑制剂(5α-还原酶抑制剂)。α受体阻滞剂是降低前列腺尿道的压力和张力的药物，包括特拉唑嗪(terazosin)、多沙唑嗪(doxazosin)、坦索罗辛(tamsulosin)以及阿夫唑嗪(alfuzosin)等，据报道有头晕、无力、头痛以及视力障碍等副作用。雄激素抑制剂是通过抑制5α-还原酶来阻止前列腺肥大的药物，包括非那雄胺(Finasteride)和度他雄胺(dutasteride)等，据报道有与性功能相关的副作用。

另一方面，已知枣皮树(Elaeagnus multriflora Thunb.)是一种种植在园林里且其果实为可食用程度的园林树木，但传统上，其果实、叶子、茎及根在中药中均被用作药物。据悉，枣皮树是自生在韩国各地的胡颓子(Elaeagnus)属植物，又名野樱桃或四月子，已知其生药名是木半夏。俗称小米饭树或多花胡颓子，幼枝上覆盖有红褐色鳞毛。外形酷似牛奶子树，但因其果实大而被栽培，故称为枣皮树，入药时主要制成汤剂来使用。

叶互生，长3～10cm，长椭圆形，两端窄而尖，边缘无锯齿。其特征为正面幼时有鳞毛，后逐渐消失，背面为白色鳞毛与棕色鳞毛混合。4月至5月开淡黄色花，腋生1～2朵花。花有白色和棕色鳞毛。萼筒下部迅速变窄，包围子房，末端分成4片，有4枚雄蕊和1枚雌蕊，7月，长度约为1.5cm的长椭圆形核果垂下并红熟。树冠呈落叶灌木状，长至2～3m的高度。

虽然外形酷似牛奶子树(Elaeagnus umbel lata Thunberg)，但牛奶子树与枣皮树的区别在于，牛奶子树的枝条上有许多白色鳞毛且果实的长度小于1cm。根据《益生養術大全》，枣皮树主要治疗循环系统疾病，对肿毒、跌打损伤、便秘、风湿、行气、行血具有良好的疗效。

通过研究这种枣皮树等传统上已知的天然物质的功效，正在努力开发几乎无副作用且有助于疾病的预防和康复的物质，但到目前为止仍然缺乏枣皮树的药用价值或生理活性功能的相关信息。

【发明内容】

【技术问题】

提供用于预防或治疗良性前列腺增生症的组合物，其利用作为天然原料的枣皮树果实提取物，因而可以安全使用而无毒副作用。

【解决问题的手段】

本发明提供用于预防或治疗良性前列腺增生症的组合物，其包含枣皮树提取物作为有效成分，上述提取物为可以利用选自由水或碳原子数为1～4的低级醇或及其混合溶剂中的一种来提取的提取物。

本发明的用于预防或治疗良性前列腺增生症的药物组合物提供可以通过包含0.1～2000mg/kg/体重/天的枣皮树果实提取物来制成，并且，可以被配制成散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬液、乳剂、糖浆剂、透皮制剂、栓剂或无菌注射液。

本发明提供用于预防或治疗良性前列腺增生症的药物组合物，其特征在于，枣皮树提取物具有抑制睾丸素诱导的前列腺(LNcap)或前列腺重量减轻、前列腺特异性抗原(PSA)、雄激素受体(AR)以及5α-还原酶2生成的活性。

【发明的效果】

本发明是以枣皮树果实提取物作为有效成分的用于预防或治疗良性前列腺增生症的组合物，利用的枣皮树资源是韩国天然资源，可以安全而无毒副作用地用作用于预防或治疗良性前列腺增生症的组合物和健康功能性食品组合物。

【附图说明】

图1为示出枣皮树果实提取物对睾丸素引起的前列腺上皮细胞系(LNCap)增生的抑制效果的曲线图。

图2为在睾丸素引起的前列腺上皮细胞系(LNCap)中前列腺特异性酶(5α-reductase 2)、雄激素受体(AR)以及前列腺特异性抗原(PSA)对蛋白质表达的影响的图。

图3为示出在睾丸素诱导的良性前列腺增生症大鼠模型中枣皮树果实提取物的处理对前列腺组织肥大的抑制效果的图。

图4为在睾丸素诱导的良性前列腺增生症大鼠模型中枣皮树果实提取物对前列腺组织的5α-还原酶含量的影响的图。

图5为在睾丸素诱导的良性前列腺增生症大鼠模型中枣皮树果实提取物对前列腺组织的前列腺特异性抗原(PSA)含量的影响的图。

【具体实施方式】

本发明涉及包含枣皮树果实提取物作为有效成分的用于预防或治疗良性前列腺增生症的组合物，将通过具体的实施例及对比例更详细地说明本发明的结构和效果。

1.枣皮树提取物的制备

1.1枣皮树果实提取物的制备

可利用选自水或碳原子数为1～4的低级醇及其混合溶剂中的一种溶剂来提取枣皮树果实提取物。具体地，在除去水分后干燥的100g枣皮树果实中加入1L蒸馏水，在回流提取器中，在100℃温度下加热3小时并提取。利用滤纸(沃特曼41号)过滤、减压以及浓缩。

利用冷冻干燥器(freeze drier)将浓缩的热水提取物在-50℃温度下冷冻干燥48小时。通过上述方法，根据提取溶剂得到12.4g(12.4％)的枣皮树果实热水提取物，并用作以下实验例的试样。

1.2枣皮树的极性溶剂、非极性溶剂以及可溶性分馏物的制备

利用有机溶剂将上述步骤中的枣皮树热水提取物分馏如下。

1.2.1己烷可溶性分馏物的分离

将12.4g枣皮树提取物完全溶解于5L蒸馏水后，放入分馏漏斗中，加入5L己烷，分离己烷不溶层(水层)和己烷可溶层。再次对己烷不溶层(水层)重复相同的工序三次，收集己烷不溶性分馏物和可溶性分馏物。

1.2.2氯仿可溶性分馏物的分离

向己烷不溶性分馏物(水层)加入5L氯仿并混合后，分离氯仿可溶性分馏物和不溶性分馏物，对氯仿不溶性层(水层)重复相同的工序三次，收集氯仿不溶性分馏物和可溶性分馏物。

1.2.3乙酸乙酯可溶性分馏物的分离

向氯仿不溶性分馏物(水层)加入5L乙酸乙酯并混合后，分离乙酸乙酯可溶性分馏物和不溶性分馏物，对乙酸乙酯不溶性层(水层)重复相同的工序三次，收集乙酸乙酯不溶性分馏物和可溶性分馏物。

1.2.4丁醇可溶性分馏物的分离

向乙酸乙酯不溶性分馏物(水层)加入5L丁醇并混合后，分离丁醇可溶性分馏物和不溶性分馏物，对丁醇不溶性层重复相同的工序三次，收集丁醇不溶性分馏物和可溶性分馏物。

1.2.5水层分馏物的分离

将12.4g枣皮树提取物完全溶解于5L蒸馏水后，放入分馏漏斗中，分离上述己烷可溶性分馏层、氯仿可溶性分馏层、乙酸乙酯可溶性分馏层以及丁醇可溶性分馏层后浓缩，除去剩余的有机溶剂并收集水分馏物。

在通过这种枣皮树热水提取物和分馏物获取过程制备的12.4g枣皮树热水提取物中，将己烷可溶性分馏物、氯仿可溶性分馏物、乙酸乙酯可溶性分馏物以及丁醇可溶性分馏物减压浓缩后冷冻干燥，并将获得的分馏物用作试样。

2.确认枣皮树果实提取物的细胞毒性

在确认本发明的枣皮树果实提取物的效果之前，进行细胞毒性检测以确定不表现细胞毒性且能够产生效果的合适浓度。

为确认枣皮树果实提取物的细胞毒性，用提取物处理前列腺癌细胞后确认了细胞存活率。将作为前列腺癌细胞系的LNCaP细胞(韩国细胞系库21740)在加入有10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、1％青霉素以及链霉素的RPMI-1640培养基(吉布科(Gibco))中在37℃、5％CO

将上述培养细胞以1×10

3.确认牛藤果实提取物对前列腺特异性抗原、雄激素受体以及5α-还原酶2表达的抑制效果

用睾丸素(Testosterone)和枣皮树果实提取物处理前列腺癌细胞后，通过确认前列腺特异性抗原(PSA)、雄激素受体(AR)以及前列腺特异性酶(5α-reductase2)的蛋白质表达来确认枣皮树果实提取物是否对良性前列腺增生症疾病有效。将LNCaP细胞以1×10

24小时后，用1μM睾丸素处理细胞，同时以0μg/ml、50μg/ml、100μg/ml及200μg/ml的浓度处理所制备的上述热水提取物后，培养细胞24小时后收集。作为阳性对照组(BPH)，仅用1μM睾丸素处理而没有用提取物处理，作为对照组(Fina)，用作为良性前列腺增生症治疗剂的10μM非那雄胺(Finasteride)代替提取物与1μM睾丸素一同处理。将未处理组用作阴性对照组(Control)。将培养后收集的细胞用RIPA缓冲液(RIPA buffer，50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、pH8.0、含150mM氯化钠、1％乙基苯基聚乙二醇、0.5％脱氧胆酸钠和0.1％十二烷基硫酸钠、含蛋白酶抑制剂混合物(50mM Tris-HCl,pH 8.0,with 150mM sodiumchloride,1％ NP-40,0.5％sodium deoxycholate,and 0.1％sodium dodecyl sulfate,with a protease inhibitor cocktail))处理并分离蛋白质。

分离的蛋白质使用蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad protein assay kit，伯乐公司(Bio-Rad)，美国(USA))进行定量后，将定量的蛋白质在10％聚丙烯酰胺凝胶上执行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。

然后，使聚偏二氟乙烯膜与5％脱脂牛奶(skim milk)反应约1小时，去除表面的非特异性结合蛋白质，利用作为第一抗体的抗-雄激素受体抗体、抗-前列腺特异性抗原抗体、抗-5α-还原酶2抗体以及抗-β-肌动蛋白抗体在4℃温度下反应一天。然后，用第二抗体在室温下处理1小时，并利用ECL试剂盒(ECL kit，赛默飞科技公司(Thermo scientific)，美国)确认雄激素受体(AR)、特异性抗原(PSA)及5α-还原酶2的蛋白质表达程度。

如图2所示，确认了用100μg/ml和200μg/ml的枣皮树果实提取物单独处理的细胞组中雄激素受体(AR)和特异性抗原(PSA)蛋白质的表达抑制效果显着优于对照组。而且，确认了用200μg/ml的枣皮树果实提取物单独处理的细胞组对5α-还原酶2蛋白质表达有抑制效果。

4.良性前列腺增生症动物的制备及前列腺重量的测定

将9周龄的雄性SD大鼠(体重为330g以下)驯养1周后，将丙酸睾酮(testosteronepropionate，TP)以3mg/kg的剂量溶解于玉米油中并皮下注射4周，从而诱导良性前列腺增生症。

注射丙酸睾酮(TP)前一小时，将在上述1.中制备的枣皮树果实热水提取物以50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg口服给药4周，作为阳性对照组，将作为用于治疗良性前列腺增生症的5α-还原酶抑制剂的非那雄胺(Finasteride；5mg/kg)以10mg/kg剂量按同样的方法给药。

从实验开始日起每隔一周共测定5次体重，最后一次给药及处理后的次日将大鼠处死，从各组(正常组；NC，良性前列腺增生症诱发组；BPH，良性前列腺增生症诱发组+非那雄胺给药组；BPH+Fina，良性前列腺增生症诱发组+枣皮树果实提取物；BPH+50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg的枣皮树果实提取物)中取出前列腺并测定它们的重量。前列腺增生抑制效果的计算公式如下。

前列腺增生抑制效果(％)＝100－{(枣皮树果实提取物给药组或阳性对照组的前列腺重量－正常组的前列腺重量)*100/(阴性对照组前列腺重量－正常组前列腺重量)}

如图3所示，确认了与由丙酸睾酮(TP)诱发良性前列腺增生症的组(BPH)相比，枣皮树果实提取物给药组(BPH+枣皮树果实)中的前列腺重量显着减少。

5.α还原酶的测定

将处死的大鼠的前列腺组织用生理盐水洗涤一次，加入4倍pH7.4磷酸盐缓冲盐水(phosphate-buffered saline，吉布科(Gibco)，美国)并用Wise Stir均质器(Wise Stirhomogenizer，大韩科学(Daihan Scientific)，韩国(Korea))进行均质化一分钟。将前列腺组织均质液在4℃、5000rpm条件下离心分离(Micro17TR，翰尼科学(Hanil Science)，韩国)5分钟来分离出上清液，利用5α-还原酶ELISA试剂盒(ELISA KIT，Mybiosource公司，美国)来测定5α-还原酶。

如图4所示，经确认，用50μg/ml、100μg/ml及200μg/ml枣皮树果实提取物单独处理的组抑制在前列腺组织的肥大过程中起关键作用的5α-还原酶的活性。

6.前列腺特异性抗原(Prostate Specific Antigen)的测定

将处死的大鼠的前列腺组织用生理盐水洗涤一次，加入4倍的pH7.4磷酸盐缓冲盐水(phosphate-buffered saline，吉布科(Gibco)，美国)并用Wise Stir均质器(Wise Stirhomogenizer，大韩科学(Daihan Scientific)，韩国)进行均质化一分钟。将前列腺组织均质液在4℃、5000rpm条件下离心分离(Micro 17TR，翰尼科学(Hanil Science)，韩国)5分钟来分离出上清液。利用特异性抗原(PSA)ELISA试剂盒(ELISA KIT，Mybiosource公司，美国)来测定特异性抗原(Prostate Specific Antigen，PSA)。

如图5所示，经确认，用ELISA确认了根据前列腺组织增加的前列腺特异性抗原(Prostatic Specific Antigen；PSA)的活性，结果，可以确认到用50μg/ml、100μg/ml及200μg/ml枣皮树果实提取物单独处理的组对前列腺特异性抗原的活性有抑制效果。

图6为示出通过实施本发明而获得的枣皮树提取物的照片。将枣皮树和果实在回流提取器中在100℃温度下加热3小时并提取，利用滤纸过滤、减压及浓缩来获得枣皮树(Elaeagnus multriflora Thunb)提取物。利用其来可以制备被配制成散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬液、乳剂、糖浆剂、透皮制剂、栓剂或无菌注射液的用于预防或治疗良性前列腺增生症的药物组合物和功能性食品。

【产业上的可利用性】

本发明是将枣皮树果实提取物作为有效成分的用于预防或抑制良性前列腺增生症的组合物，在睾丸素诱导的前列腺细胞(LNcap)和良性前列腺增生症大鼠模型中有助于表现出对良性前列腺增生症的优异的预防或抑制效果，因此，具有产业上的可利用性。