一种抗人CD209和CD209L的单克隆抗体、试剂及其应用

摘要

本发明公开了一种抗人CD209和CD209L的单克隆抗体、试剂及其应用，涉及生物医学技术领域。本发明为通过受体CD209和CD209L感染细胞的病原体感染提供了新的预防和治疗方案，抗人CD209和CD209L的单克隆抗体能够特异性识别CD209和CD209L，并与CD209和CD209L结合，从而封闭了人细胞表面受体CD209和CD209L，使得病原体的蛋白无法结合人细胞表面受体CD209和CD209L，阻断了这一类通过CD209和CD209L受体感染宿主的病原体感染宿主细胞。此外，本发明提供的单克隆抗体可用于人CD209和CD209L蛋白的检测。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种抗人CD209和CD209L的单克隆抗体、试剂及其应用。

背景技术

新冠病毒(SARS-CoV-2)持续性大流行对全球公共卫生构成严重威胁，对全球社会经济造成严重破坏。病毒通常是通过与宿主细胞表面的受体结合进入细胞，进而导致病毒感染的发生，SARS-CoV-2也不例外。血管紧张素转换酶2(ACE2)是首先被鉴定的SARS-CoV-2侵染宿主细胞的主要受体，SARS-CoV-2通过其表面糖蛋白Spike的受体结合域(RBD)与ACE2结合介导病毒进入宿主细胞[1]。但有研究发现在缺乏ACE2表达的免疫和非免疫细胞中也存在新冠病毒的易感性，说明spike蛋白可能利用其他受体进行感染。

随着研究的不断深入，越来越多的新冠病毒受体被鉴定出来，其中包括C型凝集素受体家族的两个分子CD209/DC-SIGN和CD209L/L-SIGN[2,3]。CD209与CD209L具有77％的氨基酸序列同一性，其中CD209主要表达在树突状细胞，CD209L则主要在人肝窦内皮细胞(LSEC)、淋巴内皮细胞和肺内皮细胞中表达。CD209与CD209L均是II型跨膜糖蛋白受体，它们的胞外域是由颈部区域和碳水化合物识别域(CRD)组成，其中颈部区域是23个氨基酸的重复序列，主要参与蛋白质二聚化或寡聚化，CRD则对于CD209和CD209L识别病原体上特定糖蛋白上存在的甘露糖结构至关重要。SARS-CoV-2刺突蛋白的N-糖基化主要是寡甘露糖型聚糖，这可能是SARS-CoV-2刺突蛋白与CD209和CD209L存在强结合的原因[4]。作为人类基因组中最常见的病原体识别受体成员，除SARS-CoV-2外，CD209和CD209L还可以作为SARS-CoV、埃博拉病毒、登革热病毒、HIV、流感病毒、丙型肝炎病毒等的受体介导病毒顺式或反式感染细胞[5]。因此，CD209和CD209L是抗病毒药物研究中很有前景的治疗靶点。

自从1986年第一个鼠源性单克隆抗体药物Muromonab OKT3问世以来，越来越多的单抗药物相继被批准用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等多种疾病，同时还有众多单克隆抗体正处于临床研究的不同阶段。因此，单抗药物已经成为生物医药的重要组成部分。目前市面上还没有针对SARS-CoV-2的特效药物，而已有的针对SARS-CoV-2的疫苗和靶向spike蛋白的封闭抗体随着病毒变体的不断出现其有效性也逐渐受到限制。由于新冠病毒感染细胞需要通过Spike蛋白与宿主细胞表面受体(例如，ACE2、CD209、CD209L等)结合，故利用受体的阻断性单克隆抗体同样可以阻断新冠病毒的感染，并且相对病毒疫苗和Spike蛋白的封闭抗体,针对病毒受体的阻断抗体对不断出现的病毒变体产生耐药性的可能性也会大大降低。另外，针对受体的阻断抗体不仅能够阻断新冠病毒感染宿主细胞，还能够阻断其它通过该受体感染宿主细胞的病毒。

我们和另外一个研究组发现针对受体ACE2的阻断性抗体对SARS-COV和SARS-COV-2以及SARS-COV-2的多种变体均有阻断效果就证实了这两点[6-8]。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗人CD209和CD209L的单克隆抗体、试剂及其应用，本发明为通过受体CD209和CD209L感染细胞的病原体感染提供了新的预防和治疗方案，抗人CD209和CD209L的单克隆抗体能够特异性识别CD209和CD209L，并与CD209和CD209L结合，从而封闭了人细胞表面受体CD209和CD209L，使得病原体的蛋白(例如包膜蛋白)无法结合人细胞表面受体CD209和CD209L，从而阻断了这一类通过CD209和CD209L受体感染宿主的病原体感染宿主细胞。本发明的提出具有重要的应用价值。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供了一种抗人CD209和CD209L的单克隆抗体，其包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括如下三个重链互补决定区：CDR-VH1，CDR-VH2和CDR-VH3，轻链可变区包括如下三个轻链互补决定区：CDR-VL1，CDR-VL2和CDR-VL3，CDR-VH1，CDR-VH2和CDR-VH3的氨基酸序列如SEQ ID NO：1-3所示，CDR-VL1，CDR-VL2和CDR-VL3的氨基酸序列如SEQ IDNO：4-6所示。

CDR-VH1，SEQ ID NO：1的序列为：

GFTFRDYA；

CDR-VH2，SEQ ID NO：2的序列为：

ISGGGSFT；

CDR-VH3，SEQ ID NO：3的序列为：

ARFATSTAMDY；

CDR-VL1，SEQ ID NO：4的序列为：

ESVDKFGFSF；

CDR-VL2，SEQ ID NO：5的序列为：GAS；

CDR-VL3，SEQ ID NO：6的序列为：

QQSKEVPRT。

本发明通过基因合成、载体构建，表达纯化人CD209L重组蛋白，以该重组蛋白为抗原免疫小鼠，制备单克隆抗体杂交瘤细胞株，获得小鼠抗人CD209和CD209L单克隆抗体，筛选获得能够中和、阻断人CD209和CD209L的抗人CD209和CD209L单克隆抗体。经过测序，发现该抗体具有上述重链互补决定区和轻链互补决定区。该单克隆抗体可用于CD209和CD209L蛋白的检测以及以CD209和CD209L作为标志物的相关疾病的诊断或辅助诊断。

考虑到密码子的简并性，可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，编码上述(例如Fab段)抗体的基因序列可以进行修改，获得编码相同抗体的基因；也可以根据表达抗体宿主的密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述抗体选自嵌合抗体、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv和双特异抗体中的任意一种。

上述抗体的功能性片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。

上述抗体的功能性片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。

在一种可选的实施方式中，抗人CD209和CD209L的抗体为抗人CD209和CD209L人鼠嵌合单克隆抗体或scFv。在一种可选的实施方式中，将上述抗体的轻链可变区和重链可变区进行重组，获得分子量更小的单链抗体(scFv)，该抗体同样能够特异性识别人CD209和CD209L。

在一种可选的实施方式中，抗体包括轻链骨架区FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4，和/或，重链骨架区FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4。FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4的序列依次如SEQID NO：7-10所示，FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4的序列依次如SEQ ID NO：11-14所示。

FR-L1，SEQ ID NO：7：DIAVTQSPASLAVSLGQRATISCRAS。

FR-L2，SEQ ID NO：8：MNWFQQKPGQPPKLLMY。

FR-L3，SEQ ID NO：9：

KPGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDIAMYFC。

FR-L4，SEQ ID NO：10：FGGGTKLEIK。

FR-H1，SEQ ID NO：11：EVHLVESGGGLVKPGGSLKLSCGAS。

FR-H2，SEQ ID NO：12：MSWVRQSPEKRLEWVAE。

FR-H3，SEQ ID NO：13：

FYADTVTGRFTVSRDNAKNTLYLEMSSLRSEDTAMYYC。

FR-H4，SEQ ID NO：14：WGQGASVTVSS。

需要说明的是，在其他的实施例中，本发明提供的单克隆抗体的各骨架区氨基酸序列可以与上述对应骨架区具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。

在一种可选的实施方式中，抗体还包含抗体恒定区。

在一种可选的实施方式中，抗体恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区。

在一种可选的实施方式中，抗体恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、或人。

在一种可选的实施方式中，抗体恒定区的种属来源为人。

在一种可选的实施方式中，抗体恒定区选自人IgG4。

本发明以小鼠抗体可变区和人抗体IgG4恒定区组成克隆号为7-H7-B1的人鼠嵌合单克隆抗体，并验证了其具有有效中和新型冠状病毒和冠状病毒的感染活性，能够阻断由新冠病毒(SARS-Cov-2)、冠状病毒(SRAS-Cov)以及所有通过ACE2进入细胞的病毒对人体的感染。

第二方面，本发明还提供了一种抗人CD209和CD209L的抗体在制备药物中的应用，药物用于预防或治疗通过CD209和/或CD209L受体进入细胞的病原体感染所造成的疾病。

在本发明应用较佳的实施方式中，病原体选自病毒、细菌、寄生虫或真菌。

在一种可选的实施方式中，病原体选自丝状病毒、淋巴细胞性脉络膜脑炎病毒、SARS-CoV-2、SARS-CoV、埃博拉病毒、寨卡病毒、登革热病毒、HIV、流感病毒、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒或猿猴免疫缺陷病毒。在其他实施方式中，上述病原体也可选自其他的包膜病毒。

在一种可选的实施方式中，HIV为HIV-1或HIV-2。

第三方面，本发明还提供了一种药物，该药物包括上述的抗人CD209和CD209L的抗体，药物用于预防或治疗通过CD209和/或CD209L受体进入细胞的病原体感染所造成的疾病。

上述的疾病包括但不限于病毒引起的人肺炎、肠炎、脑炎、慢性乙型肝炎、味觉嗅觉丧失、恶心、呕吐、腹泻、肤色改变、全身酸痛、体内出血、体外出血、发烧等。

上述药物还包括药学上可接受的载体，包括但不限于填充剂、润滑剂、崩解剂、粘合剂、助流剂等。

本发明的优选技术方案中，所述药学上可接受的载体包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮及其衍生物、聚乙烯醇及其衍生物、甲基纤维素及其衍生物、乙基纤维素及其衍生物、羟丙基纤维素及其衍生物、淀粉及其衍生物、聚乙二醇及其衍生物、乳糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖、山梨糖醇、糊精、微晶纤维素、丙烯酸树脂、磷酸氢钙、硬脂酸钙、硬脂酰富马酸钠、二氧化硅、二氧化钛、滑石粉、色靛中的一种或其组合。

第四方面，本发明还提供了一种由抗人CD209和CD209L的抗体在制备检测CD209或CD209L的试剂或试剂盒中的应用。

第五方面，本发明还提供了一种检测CD209或CD209L的试剂或试剂盒，其包括上述的抗人CD209和CD209L的抗体。

检测试剂例如抗人CD209和CD209L的抗体试剂、标记有容易被检测的标记物的抗体试剂，本发明提供的单克隆抗体可以特异性结合CD209和CD209L，可用于以人CD209和CD209L为标志物的相关疾病诊断或辅助诊断，这些疾病的包括但不限于人肺炎、肠炎、脑炎、慢性乙型肝炎、味觉嗅觉丧失、恶心、呕吐、腹泻、肤色改变、全身酸痛、体内出血、体外出血、发烧等。

上述抗体标记有可被检测的标记物。

可被检测的标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。

在可选的实施方式中，所述可被检测的标记物包括但不限于荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。

在实际的使用过程中，本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物，无论使用何种标记物，其均属于本发明的保护范围。

在可选的实施方式中，所述荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。

在可选的实施方式中，所述催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。

在可选的实施方式中，所述放射性同位素包括但不限于

在可选的实施方式中，所述化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。

在可选的实施方式中，所述纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。

在可选的实施方式中，所述胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。

在可选的实施方式中，所述胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。

第六方面，本发明还提供了一种表达盒或载体，其含有编码上述的抗人CD209和CD209L的抗体的基因。

第七方面，本发明还提供了一种宿主细胞，其含有上述的载体。

第八方面，本发明还提供了一种生产上述的抗人CD209和CD209L的抗体的方法，其包括：

培养上述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中分离纯化得到抗人CD209和CD209L的抗体。

在本发明公开了抗体或其功能性片段的氨基酸序列的基础上，本领域技术人员容易想到采用基因工程技术或其他技术(化学合成、杂交瘤细胞)制备得到该抗体或其功能性片段，例如从能够重组表达如上任一项所述的抗人CD209和CD209L的单克隆抗体的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该抗体或其功能性片段，这对本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论采用何种技术制备本发明的抗体或其功能性片段，其均属于本发明的保护范围。

本发明具有以下有益效果：

本发明为通过受体CD209和CD209L感染细胞的病原体感染提供了新的预防和治疗方案，抗人CD209和CD209L的单克隆抗体能够特异性识别CD209和CD209L，并与CD209和CD209L结合，从而封闭了人细胞表面受体CD209和CD209L，使得病原体的蛋白(例如包膜蛋白)无法结合人细胞表面受体CD209和CD209L，从而阻断了这一类通过CD209和CD209L受体感染宿主的病原体感染宿主细胞。本发明的提出具有重要的应用价值。

本发明提供单克隆抗体可用于人CD209和CD209L蛋白的检测以及以人CD209和CD209L作为标志物的相关疾病的诊断或辅助诊断。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为抗人CD209L和CD209的人鼠嵌合单克隆抗体抑制新冠病毒(SARS-Cov-2)感染293T-CD209L和293T-CD209细胞的统计结果图。

图2为抗人CD209L和CD209的人鼠嵌合单克隆抗体抗抑制冠状病毒(SARS-Cov)感染293T-CD209L和293T-CD209细胞的统计结果图。

图3为抗人CD209L和CD209的人鼠嵌合单克隆抗体抗抑制埃博拉病毒(苏丹亚型)感染293T-CD209L和293T-CD209细胞的统计结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试，但现在描述一些方法和材料。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。

除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratoryManual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(Current Protocols inMolecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:ThePolymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(CurrentProtocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

人CD209L重组蛋白及小鼠抗人CD209和CD209L单克隆抗体的制备。

1.制备人CD209L重组蛋白

利用基因工程技术构建人CD209L基因表达载体。我们将人CD209L cDNA构建入pATX2(酶切位点EcoRI/NotI)表达载体，转化，摇菌，提取无内毒素质粒。转染质粒(500μg)到500ml 293F细胞，待细胞活率降至50％左右，收集细胞培养上清,1000rpm离心5分钟去除细胞和细胞碎片，再10000rpm高速离心5钟后用0.45uM滤膜过滤细胞培养上清。将细胞培养上清过ProteinA亲和层析柱纯化人CD209L-Fc蛋白。

2.制备小鼠抗人CD209L和CD209单克隆抗体

(1)人CD209L-Fc重组蛋白免疫小鼠

用制备的人CD209L-Fc重组蛋白免疫4只Balb/c小鼠，在小鼠腋窝、脚掌和腹股沟皮下注射1mg/0.025ml抗原进行免疫。先进行初次免疫，再进行2-4次加强免疫，每一次的免疫间隔时间均为14天，最后一次加强免疫后第七天取小鼠血清测效价，测定效价符合标准则腹腔注射0.5ml 200ug/ml抗原溶液进行冲击免疫，三天后取脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合。

(2)细胞融合

选取进行了冲击免疫并且血清效价符合的小鼠，摘除眼球取血用于杂交瘤筛选的阳性对照，然后颈部脱臼处死小鼠置于75％的酒精中消毒至少30秒，取小鼠脾脏制备成脾细胞悬液并计数，另取SP2/0骨髓瘤细胞并计数，将脾细胞和骨髓瘤细胞按5:1的比例混合在50ml离心管中，1000rpm离心5min，弃去上清，轻弹离心管壁，松动细胞沉淀，将离心管置于37℃水浴中，向细胞沉淀内匀速加入已预热的PEG(1min内加入1ml)，加入PEG过程中，一边转动离心管一边用枪头的尖端温柔地搅拌，静止90s。匀速加入已预热的1640基本培养基(第一次)，1min内加入1ml，边加边温柔地搅拌；匀速加入已预热的1640基本培养基(第二次)，1min内加入2ml，边加边温柔地搅拌；匀速加入已预热的1640基本培养基(第三次)，3min内加入9ml，边加边温柔地搅拌；匀速加入已预热的1640基本培养基，边加边温柔地搅拌直至40ml，将离心管置于37℃水浴中静置3min。已融合的细胞悬液经800rpm离心5min，去上清，轻弹离心管壁，松动细胞沉淀，根据脾细胞数加入适量的HAT培养基，吹打混匀，接种到96孔细胞培养板，HAT选择培养基维持7～10天后换用HT培养液。在选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，收集细胞培养上清开始检测特异性抗体，筛选出含有阳性抗体的孔。

(3)ELISA检测抗体

利用CD209L和CD209重组蛋白抗原溶液100μl(2ug/ml)包被96孔酶标板，4℃孵育过夜。第二天去除包被液，加入5％脱脂牛奶300ul/孔室温封闭1小时，去除封闭液，用PBST洗涤3次，在吸水纸巾上拍干。加一抗100ul/孔37℃孵育60分钟，去除一抗，用PBST洗涤3次，在吸水纸巾上拍干。加入二抗100ul/孔37℃孵育30分钟，去除二抗，用PBST洗涤3次，在吸水纸巾上拍干。加入TMB显色液100ul/孔37℃孵育5-20min，观察显色情况，加入终止液2M盐酸50ul/孔，选择450-620nm波长，酶标仪读取吸光值。

(4)杂交瘤亚克隆

通过有限稀释法对阳性孔杂交瘤细胞进行亚克隆。将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内重悬起来计数，调整为10个细胞/ml，每孔加入稀释细胞100μl，置于37℃8％ CO

(5)生产小鼠抗人CD209L和CD209单克隆抗体

提前7-21天给小鼠腹腔注射0.5ml弗氏不完全佐剂，收集杂交瘤细胞，密度调整为2×10

(6)筛选具有阻断SARS-Cov-2、SARS-CoV和埃博拉假病毒感染的小鼠抗人CD209L和CD209单克隆抗体

将新冠假病毒(SARS-Cov-2)感染表达人CD209L和CD209的293T细胞，同时加入对照抗体和小鼠抗人CD209L和CD209单克隆抗体，37度培养箱孵育24小时收集细胞，通过荧光素酶活性测定检测SARS-Cov-2假病毒感染情况。将冠状假病毒(SARS-Cov)感染表达人CD209L和CD209的293T细胞，同时加入对照抗体和小鼠抗人CD209L和CD209单克隆抗体，37度培养箱孵育24小时收集细胞，通过荧光素酶活性测定检测SARS-Cov假病毒感染情况。将埃博拉假病毒感染表达人CD209L和CD209的293T细胞，同时加入对照抗体和小鼠抗人CD209L和CD209单克隆抗体，37度培养箱孵育24小时收集细胞，通过荧光素酶活性测定检测埃博拉假病毒感染情况。

通过细胞感染实验，我们筛选出1株能够同时阻断SARS-Cov-2、SARS-CoV以及埃博拉假病毒感染的小鼠抗人CD209L和CD209单克隆抗体：克隆号为7H7B1。

3.杂交瘤细胞测序/可变区基因测序

待杂交瘤细胞长至对数生长期收集细胞(克隆号为7H7B1)，提取杂交瘤细胞总RNA，利用3’RACE技术与5’RACE技术，RT-PCR得到与全长mRNA互补的第一链cDNA，以合成的cDNA作为模板，PCR扩增获得抗体重链与轻链可变区基因，将抗体可变区基因连接至T载体，转化并挑选阳性克隆进行测序，通过生物信息学分析测序结果，得到抗体可变区基因序列，如SEQ ID NO：1-6所示。

实施例2

CD209L和CD209重组抗体的制备

1、表达重组抗体质粒构建

将人IgG4抗体的重链和轻链的恒定区克隆入pCAGGS载体，再将获得的小鼠抗人CD209L和CD209的鼠源抗体的重链和轻链可变区插入含有人IgG4抗体恒定区的pCAGGS表达载体中，构建成重组抗体表达载体，转染293F哺乳动物细胞进行重组抗体表达(500ug/500ml)。克隆号为7H7B1的人鼠嵌合单克隆抗体是由小鼠抗体可变区和人抗体IgG4恒定区组成。

2、重组抗体的表达与纯化

转染293F细胞后继续培养5-6天，收集细胞培养上清，利用Protein G亲和层析纯化柱纯化上清中的抗CD209L和CD209重组人鼠嵌合抗体。

实施例3

抗CD209L和CD209重组人鼠嵌合抗体的特性鉴定

1、使用抗CD209L和CD209人鼠嵌合抗体进行阻断新冠病毒假病毒(SARS-Cov-2)感染表达人CD209L和CD209的细胞实验：

将新冠病毒假病毒(SARS-Cov-2)感染表达人CD209L和CD209的293T细胞，加入CD209L和CD209人鼠嵌合单克隆抗体(7H7B1，均为10ug/ml)，37度培养箱孵育24小时收集细胞，通过Promega公司的Luciferase Assay System(Cat.#E1501)进行荧光素酶活性测定检测病毒感染情况。

结果参照图1所示，结果显示，加入CD209L和CD209人鼠嵌合单克隆抗体能够显著抑制病毒的对于人CD209L(A)和CD209(B)的293T细胞的感染，阻断新冠病毒假病毒(SARS-Cov-2)感染。且具有一定的浓度依赖性，CD209L和CD209人鼠嵌合单克隆抗体的浓度越高，阻断效果越好。

2、使用抗C209L和CD209人鼠嵌合抗体进行阻断冠状病毒(SARS-Cov)感染表达人CD209L和CD209的细胞实验：

将冠状病毒(SARS-Cov)假病毒感染表达人CD209L和CD209的293T细胞，加入CD209L和CD2092人鼠嵌合单克隆抗体(7H7B1，均为10ug/ml)，37度培养箱孵育24小时收集细胞，通过Promega公司的Luciferase Assay System(Cat.#E1501)进行荧光素酶活性测定检测病毒感染情况。

结果参照图2所示，结果显示，加入CD209L和CD209人鼠嵌合单克隆抗体能够显著抑制冠状病毒的对于人CD209L(C)和CD209(D)的293T细胞的感染，阻断冠状病毒感染。且具有一定的浓度依赖性，CD209L和CD209人鼠嵌合单克隆抗体的浓度越高，阻断效果越好。

3、使用抗C209L和CD209人鼠嵌合抗体进行阻断埃博拉假病毒感染表达人CD209L和CD209的细胞实验：

将埃博拉假病毒感染表达人CD209L和CD209的293T细胞，加入CD209L和CD2092人鼠嵌合单克隆抗体(7H7B1，均为10ug/ml)，37度培养箱孵育24小时收集细胞，通过Promega公司的Luciferase Assay System(Cat.#E1501)进行荧光素酶活性测定检测病毒感染情况。

结果参照图3所示，结果显示，加入CD209L和CD209人鼠嵌合单克隆抗体能够显著抑制埃博拉假病毒的对于人CD209L(E)和CD209(F)的293T细胞的感染，阻断埃博拉假病毒感染。且具有一定的浓度依赖性，CD209L和CD209人鼠嵌合单克隆抗体的浓度越高，阻断效果越好。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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