一种动物脂肪来源间充质前体细胞的分离与分化方法

摘要

本发明公开了一种动物脂肪来源间充质前体细胞的分离与分化方法，其特征在于，包括：先对动物脂肪初步分离得到含间充质前体细胞的混合细胞群，然后通过流式分选标志物进行分选和纯化，得到动物脂肪来源间充质前体细胞；将动物脂肪来源间充质前体细胞培养后接触抑制，然后加入诱导成脂分化培养基培养，显微镜下观察细胞形态，当观察到细胞形态正常并且微小脂滴出现并位于细胞胞浆内时，加入维持分化培养基培养，等待分化完全后进行鉴定与检测，完成分化。本发明极大提高小鼠原代细胞诱导成脂的分化率，使之分化为最符合该组织解剖学原位性质的成熟脂肪细胞并满足临床科学研究需要。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞生物技术领域，具体涉及一种动物脂肪来源间充质前体细胞的分离与分化方法。

背景技术

主动脉血管周围脂肪组织(PVAT)是一种与主动脉血管壁相连的脂肪库，因为特殊的解剖学部位导致其可能不仅具备血管支撑功能，还能通过自分泌与旁分泌作用将脂肪因子作用于其他周围脂肪细胞和血管壁，进而影响血管生理稳态。PVAT在心血管疾病的发生发展中起关键作用。在血管病理学中，主动脉血管周围脂肪组织体积增加并逐渐功能失调，其细胞组成和分子特征也发生改变。PVAT功能障碍的特征主要在于其炎症特征、氧化应激、血管保护性脂肪细胞衍生的松弛因子减少以及旁分泌因子如抵抗素、瘦素、细胞因子TNF-α和趋化因子的增加如MCP-1等。这些脂肪细胞衍生因子刺激和协调主要包括T细胞、巨噬细胞、树突细胞、B细胞和NK细胞的炎症细胞浸润。并且，主动脉血管周围脂肪所分泌的脂联素等保护性因子可以减少NADPH氧化酶超氧化物的产生并增加血管壁中一氧化氮的生物利用度，但是主动脉血管周围脂肪若处于在炎症环境中，其分泌的促炎因子会诱导内皮、血管平滑肌细胞和外膜成纤维细胞中的血管氧化酶和一氧化氮合酶eNOS的功能障碍。所有这些事件都将功能失调的主动脉血管周围脂肪与血管功能障碍联系起来，而这些机制在包括动脉粥样硬化、高血压、糖尿病和肥胖症在内的许多心血管疾病中都非常重要，越来越多的研究学者对主动脉血管周围脂肪组织研究产生极大兴趣。

由于成熟的脂肪细胞胞浆内80％-90％的由脂滴组成，并且为终末分化细胞分离提纯后也不能贴壁传代培养，这为血管周围脂肪组织的相关研究带来极大困难。脂肪来源的前体间充质细胞是从脂肪组织中分离提纯得到的一类具有多分化潜能的干细胞，能在体外大规模培养和扩增，性质稳定，在一定的诱导因子作用下分化成软骨、成骨、脂肪、神经等类型的细胞，并在临床研究与医美等领域应用广泛。原代脂肪来源的前体间充质干细胞与常用脂肪前体干细胞系相比，能够更还原该类脂肪组织的在机体内的生理功能，相关性状和内在调控作用机制，因而在科学研究中日渐受到青睐。而小鼠作为研究动脉粥样硬化最优的模式生物，并且基因改造、繁育较易，可较易获得大量主动脉血管周围脂肪组织，因此我们选用小鼠主动脉血管周围脂肪组织来源的前体间充质细胞作为研究对象，对原代细胞分离培养与分化方案进行不断实践。

现有的制作工艺中，针对小鼠主动脉血管周围脂肪组织来源的原代前体间充质细胞的体外分离、培养与分化方法非常缺乏。诸多待解决的技术难题，如组织部位的采集、缓冲清洗液的选择、酶消化及差速离心方案的确定、流式分选干细胞蛋白标记物的选择、原代细胞扩增培养及冻存方案的确定以及诱导培养基分化方案的确定等亟待解决。并且由于胸、腹主动脉血管周围脂肪组织的解剖学特殊性且兼具异质性，现有制作工艺中还很可能产生脂肪组织采集部位不准确、分离提纯步骤繁琐时间较长，脂肪组织消化过度或不足、原代细胞体外培养易污染、有核细胞得率低、细胞存活率较低、细胞纯度与产量不高、成脂分化率低且难以控制、干细胞流式结果不理想等诸多问题。更重要的是，现有的成脂分化技术，即标准鸡尾酒法诱导成脂分化培养基及分化方案，难以诱导脂肪来源的原代干细胞成脂分化，应用该成脂方案很大可能导致原代细胞失去其本来特性与定向分化能力。为克服上述不足，发明人经过不断实践，从而建立高产、高纯度、分化可控、性质稳定且更贴合其组织部位表型及性质的原代小鼠主动脉血管周围脂肪来源间充质干细胞分离与分化方法，对于研究筛选潜在治疗心血管疾病药物小分子靶点中具有重要意义，也为血管病理临床研究提供相应的技术支持。

现有制作工艺中针对于该脂肪组织来源的原代前体间充质细胞的体外分离、培养与分化的技术手段非常缺乏，且过程纷繁复杂且耗时费力、生产倍增，实际操作后获得的原代细胞产量、纯度、活力与可分化率等方面均不理想。由于小鼠胸、腹主动脉血管周围脂肪组织(tPVAT为胸主动脉血管周围脂肪组织；aPVAT为腹主动脉血管周围脂肪组织)的解刨学特殊性与异质性，制作工艺中会出现采集部位不准确、酶解消化脂肪不充分、体外培养易污染、分选蛋白标志物选择不准确、细胞产量及纯度低、成脂分化率低等诸多问题。

现有针对前体间充质干细胞的成脂分化技术，即标准的鸡尾酒法诱导成脂分化方案一般用于较易分化的3T3-L1白色脂肪前体细胞株，但是难以诱导原代小鼠脂肪间充质前体细胞进行高效有效的成脂分化。为了更加贴合主动脉血管周围脂肪组织原位的棕色米色脂肪特性及表型，使之被定向诱导成脂，需在原有分化方案基础上尝试新的成脂刺激药物及药物配比。为解决现有技术存在的问题，本发明针对实践过程中可能出现上述这些问题，经过多次实践努力尝试形成并首次公开一个相对较完善、耗时短、可操作性强、分化高效且更贴合其组织部位表型及性质的原代小鼠主动脉血管周围脂肪来源间充质前体干细胞分离分化方法，从而完成了本发明。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种动物脂肪来源间充质前体细胞的分离与分化方法。

一种动物脂肪来源间充质前体细胞的分离与分化方法，其特征在于，包括：

1)先对动物脂肪初步分离得到含间充质前体细胞的混合细胞群，然后通过流式分选标志物进行分选和纯化，得到动物脂肪来源间充质前体细胞；

2)先将动物脂肪来源间充质前体细胞培养后接触抑制，然后加入诱导成脂分化培养基培养，显微镜下观察细胞形态，当观察到细胞形态正常并且微小脂滴出现并位于细胞胞浆内时，加入维持分化培养基培养，等待分化完全后进行鉴定与检测，完成分化。

步骤1)中，所述的流式分选标志物为Pdgfra蛋白或/和Sm22a蛋白。

所述的Pdgfra蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的Sm22a蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

步骤2)中，将动物脂肪来源间充质前体细胞培养2～3天后接触抑制2～3天。进一步优选，将动物脂肪来源间充质前体细胞培养2天后接触抑制2天。

加入诱导成脂分化培养基培养3～5天。进一步优选，加入诱导成脂分化培养基培养4天。

步骤2)中，加入诱导成脂分化培养基步骤和维持分化培养基步骤均每一天或每两天全量更换相应培养液。

步骤2)中，所述的诱导成脂分化培养基由以下组分构成：DMEM高糖培养基、FBS、Dex、IBMX、胰岛素、吲哚美辛与3,3',5'-三碘-L-甲状腺氨酸；

所述的FBS的用量为DMEM高糖培养基质量的8～12％；

所述的Dex的用量为DMEM高糖培养基体积的0.5～2μmol：1L；；

所述的IBMX与DMEM高糖培养基体积比为0.3～0.8mmol：1L；

所述的胰岛素与DMEM高糖培养基体积的15～25nmol：1L；

所述的吲哚美辛与DMEM高糖培养基体积的100～150nmol：1L；

所述的3,3',5'-三碘-L-甲状腺氨酸为DMEM高糖培养基体积的0.5～2nmol：1L。

最优选的：

所述的FBS的用量为DMEM高糖培养基质量的10％；

所述的Dex的用量为DMEM高糖培养基体积的1uM；

所述的IBMX与DMEM高糖培养基体积比为0.5mmol：1L；

所述的胰岛素与DMEM高糖培养基体积的20nmol：1L；

所述的吲哚美辛与DMEM高糖培养基体积的125nmol：1L；

所述的3,3',5'-三碘-L-甲状腺氨酸为DMEM高糖培养基体积的1nmol：1L。

加入维持分化培养基培养4-8天。所述的维持分化培养基由以下组分构成：DMEM高糖培养基、FBS、胰岛素和3,3',5'-三碘-L-甲状腺氨酸；

所述FBS的用量为DMEM高糖培养基质量的8～12％；

所述的胰岛素为DMEM高糖培养基体积的15～25nmol：1L；

所述的3,3',5'-三碘-L-甲状腺氨酸为DMEM高糖培养基体积的0.5～2nmol：1L。

最优选的：

所述FBS的用量为DMEM高糖培养基质量的10％；

所述的胰岛素为DMEM高糖培养基体积的20nmol：1L；

所述的3,3',5'-三碘-L-甲状腺氨酸为DMEM高糖培养基体积的1nmol：1L。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明第一方面首次公开小鼠主动脉血管周围脂肪来源间充质前体干细胞的分离、培养与冻存方法，获得有核细胞得率高，分离时间短，细胞存活率高，传代可达10代以上，该所述方法具体包括以下步骤：

1)收集脂肪组织：用戊巴比妥生理盐水溶液腹腔注射小鼠使其安乐死，在无菌超净台中解剖数只小鼠并收集其胸、腹主动脉血管周围脂肪组织，以及对照组白色附睾周围脂肪组织；

步骤1)所述小鼠选取6-8周小鼠，戊巴比妥生理盐水溶液浓度为70ug/g，于体视镜下以每5只小鼠作为一个样品采集组织；

2)清洗组织：用生理学相容性缓冲溶液清洗收集的脂肪组织，显微镜下去除多余血液凝块、破碎脂肪与杂质等；

步骤2)所述生理学相容性缓冲溶液为经过无菌过滤添加1％-3％青链霉素(10,000Units/ml青霉素和10,000ug/ml链霉素)pH值为7.4的KRB缓冲溶液(Krebs-Ringerbicarbonate buffer)。KRB缓冲溶液组分为：129mM氯化钠，5mM碳酸氢钠，4.8mM氯化钾，1.2mMKH 2PO 4，1.0mM氯化钙，1.2mM硫酸镁，10mMHEPES，0.1％BSA。

3)酶解脂肪组织：将预热的I型胶原蛋白酶溶液以合适比例加入脂肪组织，混匀放置在37℃恒温转子上，旋转孵育直至组织消化充分；

步骤3)所述酶解消化液包含胶原酶I与白蛋白。消化液组分为：0.1％-0.5％胶原酶Ⅰ，63.47μg/ml-126.94μg/ml氯化镁，1.5％-3％白蛋白，1％-3％青链霉素(10,000Units/ml青霉素和10,000ug/ml链霉素)、其余为DMEM培养液，以上为质量百分比浓度。其中使用：胶原酶Ⅰ的浓度为0.1％，氯化镁溶液的浓度为63.47μg/ml，白蛋白的浓度为1.5％。

步骤3)所述最佳酶解方案：以每50mg净重不同部位小鼠脂肪组织加入10mL预热I型胶原蛋白酶酶液(800U/ml)比例进行酶解，混合均匀后37℃75rpm旋转孵育35分钟直至消化充分，每10min观察组织以免消化过度细胞活力下降；小鼠白色附睾脂肪最佳酶解方案：I型胶原蛋白酶酶液最佳浓度为300U/ml，旋转孵育时间缩短至30分钟，其他方法与上述方案一致。

4)差速离心获取杂细胞团块：加入常用标准培养基如5％-15％胎牛血清(FBS)的DMEM(Dulbeccos modified Eagle medium)高糖或D/F12高糖标准培养基终止酶解，用平均密度离心方法分离获取大量脂肪来源间充质前体干细胞的杂细胞团；

步骤4)所述酶解终止液为10％FBS的DMEM高糖标准培养基，终止消化后4℃500g转速离心5min。离心后剧烈涡旋混匀离心后的液体与沉淀，并再用相同方法离心细胞悬液，得到杂细胞团。

5)去血细胞提纯细胞团块：离心弃上清后，将沉淀的杂细胞团红细胞裂解液清洗重悬，破坏残留的血细胞。然后离心并加入新鲜培养基重新悬浮，在经过多次重复离心加入培养基重悬的操作后可获得纯度较高的间充质前体干细胞；

6)过滤细胞与培养：离心后的细胞用细胞过滤筛进行过滤，并将滤液离心。在离心完毕弃上清后，加入预热的新鲜培养基重悬细胞后置于培养皿中，于37℃恒温5％二氧化碳浓度饱和湿度细胞培养箱中培养，培养传代后的胸、腹主动脉血管周围脂肪来源的原代间充质前体干细胞形态如附图1所示；

步骤6)所述细胞分别用100um与40um细胞筛依次过滤效果最佳，原代细胞培养皿用0.1％明胶包被30分钟以上并预热后培养细胞效果最佳。

7)扩大培养：在原代细胞培养第24小时后将皿中培养液全量换掉，用PBS溶液洗涤两遍去除未贴壁细胞，加入新鲜培养基，待细胞全部长满后，进行细胞传代扩培。细胞经过PBS洗涤后加入胰酶37℃消化原代前体干细胞数分钟，加入新鲜培养基终止消化，收集细胞悬液后离心吸弃上层液体，加入新鲜培养基混匀重悬，悬液接种至数盘培养皿，于细胞培养箱培养直至细胞长满；

8)流式分选与鉴定：扩培的原代细胞用胰酶消化方法消化并收集，根据文献中胸、腹小鼠主动脉血管周围脂肪来源间充质前体干细胞的细胞表面标记蛋白，用相应的流式抗体标记所收集的原代细胞，用流式细胞仪进行细胞分选，分选后的细胞即为高纯度主动脉血管周围脂肪来源间充质前体干细胞。经过流式分选后的细胞继续用上述7)扩培方式培养两代，取少量扩培后原代干细胞用分析型流式细胞仪进行相应细胞表面标记蛋白鉴定，其中tPVAT来源的间充质干细胞特异性表面标记选用Pdgfra、aPVAT来源的间充质干细胞特异性表面标记选用Sm22a，流式鉴定结果如附图2所示；

9)原代细胞活力及内毒素检测：将步骤8)中扩培的原代细胞胰酶消化收集，将离心后的上清取部分用做细胞内毒素的检测；收集的细胞沉淀用培养液适量重悬，进行细胞量和细胞活力检测；

10)传代冻存：将步骤8)中扩培的原代细胞用冻存液重悬，细胞悬液混匀后转移分装到商品化冻存管内，封盖贴便签，迅速转移至程序降温仪内，待温度冷却至-80℃后转移至待检库内，待检测结果合格后转移至细胞库内长期液氮低温保存。

步骤10)所述最佳冻存方案为原代脂肪间充质干细胞以8×10

(2)本发明第三方面首次公开了小鼠主动脉血管周围脂肪来源间充质前体干细胞的成脂诱导分化方案，具体包括以下步骤：

1)小鼠主动脉血管周围脂肪来源间充质前体干细胞的铺板与培养：将用上述方法获得的间充质干细胞铺于6孔或12孔或更小的孔板中，保证铺板细胞在48小时内生长融合至90％以上，并更换全量更换新鲜培养基继续在培养箱中培养数天后开始分化。

步骤(2)1)所述间充质干细胞按照约1×10

2)小鼠主动脉血管周围脂肪来源间充质前体干细胞的诱导成脂分化培养基成分选择：

现有技术中诱导成脂分化培养基一般为含有5％-15％FBS的DMEM高糖标准培养基加上一定浓度的皮质激素地塞米松(Dex)、磷酸二酯酶抑制剂3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)与胰岛素共同混合组成，其三种药物工作浓度一般为：1uM Dex、0.5mM IBMX与1ug/ml胰岛素。分化维持培养基一般为5％-15％FBS的DMEM高糖标准培养基加上一定浓度的胰岛素，一般胰岛素的作用浓度为1ug/ml。这种鸡尾酒法培养基可诱导白色脂肪前体细胞株，但难以诱导脂肪来源的原代干细胞成脂分化，应用该成脂方案很大可能导致原代细胞失去其本来特性与定向分化能力，因而针对小鼠原代主动脉血管周围脂肪来源的间充质前体细胞使之进行高效与有效的成脂分化，本发明首次公开其诱导成脂的分化配方与分化方案。

步骤(2)2)所述，本发明首次公开分化培养基成分与分化方案，使分化后的细胞更贴合小鼠主动脉血管周围脂肪组织所具备的特性及表型。

本发明中胸、腹主动脉周围脂肪对应棕、米色脂肪表型，这两类脂肪的诱导成脂分化培养基组分为：10％FBS、DMEM高糖培养基、1uM Dex、0.5mM IBMX、20nM胰岛素、125nM吲哚美辛(Indomecin)与1nM 3,3',5'-三碘-L-甲状腺氨酸(T3)；维持分化培养基为10％FBS、DMEM高糖培养基、20nM胰岛素与1nM T3；而附睾白色脂肪诱导成脂分化培养基为10％FBS、DMEM高糖培养基、1uM Dex、0.5mM IBMX、20nM胰岛素与1uM罗格列酮；维持分化培养基为10％FBS、DMEM高糖培养基、20nM胰岛素与1uM罗格列酮。

3)成脂分化方案：在原代细胞铺板培养2天接触抑制2天后，加入诱导成脂分化培养基培养4天，显微镜下观察细胞形态，当观察到细胞形态正常并且微小脂滴出现并位于细胞胞浆内时，加入维持分化培养基4-6天，以上步骤均两天全量更换相应培养液，等待分化完全后进行鉴定与检测。胸、腹主动脉血管周围脂肪组织来源的间充质前体干细胞分化不同时期的细胞形态如附图3所示。

步骤(2)3)所述分化后期成熟脂肪细胞变多后，细胞层容易打卷、漂起来，造成样品损失，换液时需轻柔，吸走旧培液时要轻并慢，避免枪头直接触碰细胞层；加入新鲜培液时用移液器从侧壁缓慢将液滴加入，防止液体直接冲击细胞层。诱导成脂分化培养基在加入细胞后培养不得超过4天以上，维持分化培养基加入细胞后培养不可超过6天以上，否则分化细胞状态变差容易漂浮。

4)成脂分化相关形态鉴定：用油红O染色分化后的原代细胞，显微镜下观察细胞形态法进行细胞表型鉴定。在加入诱导分化培养基4天以后就可以观察到细胞内油滴的生成，并且持续加入诱导分化培养基细胞内油滴增多。并且根据相关文献内容，根据细胞胞浆内油滴的大小分布可以对不同类型脂肪细胞进行表型鉴定，分化后的成熟白色脂肪细胞含有许多体积较大的单房脂滴，细胞呈多边形，细胞核位于细胞的边缘，并含有少量的线粒体。白色脂肪细胞的脂肪油滴呈单房并且油滴体积较大，而棕色或米色脂肪细胞含有多房小脂滴，分布细胞胞浆内各个地方，富含线粒体。胸、腹主动脉血管周围脂肪组织来源的间充质前体干细胞分化后经油红O染色，细胞表型结果如附图4所示。

5)成脂分化相关蛋白标志物的检测：用实时荧光定量核酸扩增qPCR法及Westernblot蛋白质印迹法法检测细胞成脂分化相关蛋白标志物。

步骤(2)5)所述细胞成脂分化相关蛋白标志物是指，前体脂肪干细胞向白色脂肪细胞方向分化时，白色脂肪标志基因如PPARa、PPARy、Adiponectin、Fabp4基因会高表达；向棕色脂肪细胞方向分化时，除了与白色脂肪类似的成熟脂肪基因高表达之外，还额外高表达如Dio2、Prdm16、PGC1-α、Elovl3、Cox7a1和Ucp1等棕色脂肪标志基因。前体细胞向米色脂肪细胞方向分化时，除了与白色脂肪类似的成熟脂肪基因高表达之外，还额外高表达如Tbx1、Slc27a1、CD40、CD137及CITED1等米色脂肪标志基因。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、使用特定的KRBS缓冲液替代生理盐水保存与清洗脂肪组织样本，保护脂肪组织而不影响其前体干细胞的得率。

2、在2019年发表的文献《Single-Cell RNA-Sequencing and MetabolomicsAnalyses Reveal the Contribution of Perivascular Adipose Tissue Stem Cells toVascular Remodeling》(Gu W,Nowak WN,Xie Y,Le Bras A,Hu Y,Deng J,Issa Bhaloo S,Lu Y,Yuan H,Fidanis E,Saxena A,Kanno T,Mason AJ,Dulak J,Cai J,Xu Q.Single-Cell RNA-Sequencing and Metabolomics Analyses Reveal the Contribution ofPerivascular Adipose Tissue Stem Cells to Vascular Remodeling.ArteriosclerThromb Vasc Biol.2019Oct；39(10):2049-2066.)中，仅简单用PBS缓冲液与高浓度I型胶原酶作为消化液消化小鼠血管周围脂肪，且需要长时间用高速转子孵育器消化组织，对组织样品消耗很大且容易过度消化从而降低前体干细胞得率与活性。而此方法使用KRB缓冲液贴合脂肪组织生理缓冲环境，用低浓度的0.1％的I型胶原酶消化酶来消化脂肪组织，加入1.5％的牛血清白蛋白来保护细胞免受过度消化,另外还加入酶激活剂氯化镁来促进消化酶的消化作用。此种方法消化组织只需35分钟即可，并且此种方法加入牛血清白蛋白酶解来保护细胞，所以得到前体脂肪干细胞的存活率更高可为96.2±3％，且所得有核细胞数量较上述文献方法所得更多。

3、分离下来的脂肪前体杂细胞团加入红细胞裂解液裂解多余残留的红细胞，在经过多次重复离心加入培养基重悬的操作后可快速获得纯度较高的间充质脂肪前体干细胞。相比使用生理盐水混匀组织后利用组织和红细胞的沉降原理吸取上层组织来去除沉降的红细胞的传统方法时间更短，所得干细胞更纯。

4、在2018年发表的文献《Improved GMP compliant approach to manipulatelipoaspirates,to cryopreserve stromal vascular fraction,and to expand adiposestem cells in xeno-free media》中，冻存后细胞存活率仅为：69.0±3.2％，而此方法用无血清冻存液加入血清替代物，可使冻存后细胞的存活率高达96％±4％。

5、在现有技术中国专利《脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法》中，直接从脂肪组织中获取原代脂肪前体干细胞不同的是，本发明方法中是用扩培后胰酶消化并收集的前体脂肪干细胞，根据文献中胸、腹小鼠主动脉血管周围脂肪细胞的表面标记蛋白Sm22a与PDGFRa，用流式细胞仪进行细胞分选，分选后得到大量的高纯度小鼠主动脉血管周围脂肪来源的间充质前体干细胞。

6、在现有技术中国专利《一种脂肪来源干细胞向脂肪细胞诱导分化的方法与应用》中，用含有10％FBS、0.5mM异丁基-甲基黄嘌呤IBMX、1uM地塞米松、10uM胰岛素、200uM吲哚美辛的DMEM培养基诱导脂肪前体干细胞分化7-15天收获成熟脂肪细胞。而此种方法诱导前体干细胞分化为两步鸡尾酒分化法，首先用组分为10％FBS、1uM地塞米松Dex、0.5mMIBMX、20nM胰岛素、125nM吲哚美辛(Indomecin)与1nM 3,3',5'-三碘-L-甲状腺氨酸(T3)的DMEM高糖培养基诱导前体干细胞分化4天；再用组分为10％FBS、20nM胰岛素与1nM T3的DMEM高糖培养基维持前体干细胞分化4天，总共分化与维持仅需8天即可收获成熟脂肪细胞，且用该方法前体干细胞分化率可达97％以上。而且本发明的分化方案针对小鼠主动脉血管周围脂肪组织的棕色米色脂肪特征，如多线粒体、多房脂滴、多表达产热蛋白等特点，添加了甲状腺激素三碘甲状腺原氨酸(T3)通过增加产热蛋白UCP1蛋白促进脂肪细胞中的电子传递与线粒体中ATP的合成解偶联来激活产热，从而既提高了脂肪前体干细胞的诱导成脂分化率，又可以使前体干细胞分化成带有血管周围脂肪细胞表面蛋白的成熟棕色或米色脂肪细胞。本发明制备的脂肪干细胞可以直接应用于临床试验。

相对于现有技术，本发明的组织酶解方案更加简洁，简化了操作生产工艺、提纯分离与培养扩增过程。该方法可以显著提高小鼠主动脉血管周围脂肪来源间充质前体干细胞的细胞产量、纯度、细胞活性与细胞性质，并有效降低细胞制备的成本。本发明针对小鼠主动脉血管周围脂肪组织的特性与异质性形成高效的成脂诱导分化方案，从而极大提高小鼠原代细胞诱导成脂的分化率，使之分化为最符合该组织解剖学原位性质的成熟脂肪细胞并满足临床科学研究需要。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1是小鼠原代主动脉血管周围脂肪来源间充质前体干细胞形态图(X100倍)；

a.胸主动脉血管周围脂肪来源原代间充质前体干细胞；

b.腹主动脉血管周围脂肪来源原代间充质前体干细胞；

图2是小鼠原代主动脉血管周围脂肪来源间充质前体干细胞细胞流式分析图；

a.FITC阴性对照；b.PE阴性对照；c.APC阴性对照；

d.AF 647阴性对照；e.PB450阴性对照；f.PE-Cy7阴性对照；

g.CD34表达阴性；h.CD31表达阴性；i.CD19表达阴性；

j.CD45表达阴性；k.CD73表达阳性；l.CD90表达阳性；

m.CD146表达阳性；n.PDGFRa表达阳性(tPVAT)；o.SM22a表达阳性(aPVAT)；

图3是小鼠原代主动脉血管周围脂肪来源间充质前体干细胞成脂分化形态图；

a.胸主动脉血管周围脂肪来源间充质前体干细胞成脂诱导分化培养四天，少数细胞内开始出现小脂滴；

b.胸主动脉血管周围脂肪来源间充质前体干细胞成脂诱导分化培养六天，细胞内出现脂滴；

c.胸主动脉血管周围脂肪来源间充质前体干细胞成脂诱导分化培养八天，细胞内充满多房脂滴；

d.腹主动脉血管周围脂肪来源间充质前体干细胞成脂诱导分化培养四天，少数细胞内开始出现小脂滴；

e.腹主动脉血管周围脂肪来源间充质前体干细胞成脂诱导分化培养六天，细胞内出现脂滴；

f.腹主动脉血管周围脂肪来源间充质前体干细胞成脂诱导分化培养八天，细胞内充满多房与单房脂滴；

图4是小鼠原代脂肪来源间充质前体干细胞成脂分化后油红O染色图；

a.胸主动脉血管周围脂肪来源间充质前体干细胞分化染色图；

b.腹主动脉血管周围脂肪来源间充质前体干细胞分化染色图；

图5是小鼠原代脂肪来源间充质前体干细胞成脂分化相关基因转录水平检测；

a.胸主动脉血管周围脂肪来源间充质前体细胞成脂分化前(黑色柱状)分化后(灰色柱状)基因转录水平；

b.胸主动脉血管周围脂肪间充质前体细胞成脂特异性分化(灰色柱状)基因转录水平(对照为成脂分化后附睾周围脂肪来源间充质前体细胞(黑色柱状))；

c.腹主动脉血管周围脂肪来源间充质前体细胞成脂分化前(黑色柱状)分化后(灰色柱状)基因转录水平；

d.腹主动脉血管周围脂肪间充质前体细胞成脂特异性分化(灰色柱状)基因转录水平(对照为成脂分化后附睾周围脂肪来源间充质前体细胞(黑色柱状))；

图6是小鼠原代脂肪来源间充质前体干细胞成脂分化相关蛋白表达的检测；

a.胸主动脉血管周围脂肪来源间充质前体干细胞(tPVATADSCs)成脂分化相关关键蛋白表达水平(对照为附睾周围脂肪来源间充质前体细胞(eWATADSCs)成脂分化的相关关键蛋白蛋白)；

b.腹主动脉血管周围脂肪来源间充质前体干细胞(aPVATADSCs)成脂分化相关关键蛋白表达水平(对照为附睾周围脂肪来源间充质前体细胞成脂分化的相关关键蛋白蛋白)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择，本发明案例中的所有试剂及动物均市售可得。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在实施本发明小鼠主动脉血管周围脂肪来源前体间充质干细胞的分离与分化方法前，需要进行小鼠培养与实验室准备工作，具体工作内容如下：

1、实验动物的购买和饲养

SPF级C57BL/6小鼠，18-22g，雄性，动物由上海南方模式动物中心提供。小鼠分笼饲养，每笼4-5只放置于浙江大学实验动物中心饲养，空调控制室温23-26℃之间，相对湿度55±10％以内，照明12小时昼夜周期实施，摄食及饮水自由摄取。动物的管理与使用流程符合实验动物使用与管理的国家标准，并得到浙江大学实验动物福利伦理审查委员会的批准。

2、实验药品及试剂

(1)手术器械：准备手术尖头镊子，手术解剖镊子，手术直头弯头剪刀，解剖弯头镊子，精细手术钳，弹簧剪等手术器械数把并在解剖手术前进行高压灭菌。

(2)KRB缓冲洗涤液配制：于双蒸水中溶解118mM NaCl、5mM KCl、2.5mM CaCl2、2mMKH2PO4、2mM MgSO4、25mM NaHCO3和5mM葡萄糖，同时添加适量青霉素-链霉素双抗，调节pH值为7.4加水定容至1L，0.22um过滤除菌-20℃储存。

(3)消化胸、腹主动脉血管周围脂肪组织酶液的配制：0.1％I型胶原蛋白酶溶于KRB缓冲液并添加2mM Cacl2与1.5％牛血清白蛋白(BSA)配置，待固体完全溶解后溶液用0.22um过滤器过滤除菌，37℃水浴预热1小时；对于消化白色附睾脂肪(作为对照)，I型胶原蛋白酶浓度为0.05％。

(4)消化终止液：添加10％胎牛血清FBS与1X双抗溶液的DMEM高糖培养基。

(5)红细胞裂解液：溶液购买自碧云天生物技术有限公司。

(6)明胶包被溶液：1g明胶固体溶解于PBS缓冲溶液中配成0.1％明胶溶液。

(7)流式抗体：FITC、PE、APC、AF 647、PE-Cy7、PB450、CD34、CD31、CD19、CD45、CD73、CD90、CD146、PDGFRa与SM22a抗体购买自eBioscience和abcam公司；

(8)冻存液：无血清干细胞冻存液，低温4℃保存。

(9)2.5mM地塞米松储存液(2500×)配制：10mg溶于10ml无水乙醇后，过滤除菌-20℃储存。

(10)1mM IBMX储存液(500×)配制：55.6mg溶于1ml 0.35M氢氧化钾溶液后，过滤除菌-20℃储存。

(11)125mM吲哚美辛储存液(1000×)配制：10mg溶于1ml DMSO后，用2.5％碳酸氢钠溶液稀释10倍，过滤除菌-20℃储存。

(12)1mg/ml胰岛素储存液(1000X)配制：1mg/ml浓度溶于0.01M稀盐酸溶液后，过滤除菌-20℃储存。

(13)1uMT3储存液(1000X)配制：1mg/ml浓度溶于1M氢氧化钠溶液做为母液，每6.5ul母液加10ml新鲜完全培养基稀释，过滤除菌-20℃储存。

(14)1mM罗格列酮储存液(1000X)配置：10mg/ml浓度溶于DMSO做为母液，每71.4ul母液加1.93ml新鲜完全培养基稀释，0.22um过滤除菌-20℃储存。

(15)棕色米色主动脉血管周围脂肪组织来源的原代细胞成脂分化培养基：10％FBS、DMEM高糖培养基、1X双抗、1uMDex、0.5mM IBMX、20nM胰岛素、125nM吲哚美辛(Indomecin)与1nM 3,3',5'-三碘-L-甲状腺氨酸(T3)；其维持分化培养基为10％FBS、DMEM高糖培养基、20nM胰岛素与1nM T3。

(16)附睾白色脂肪组织来源的原代细胞成脂分化培养基：10％FBS、DMEM高糖培养基、1uMDex、0.5mM IBMX、20nM胰岛素与1uM罗格列酮；维持分化培养基为10％FBS、DMEM高糖培养基、20nM胰岛素与1uM罗格列酮。

(17)油红O染液配制：0.2g油红O加入100ml异丙醇，56℃溶解1小时，冷却后过滤作为储存液。使用时取储存液与双蒸水以6:4比例混匀，静置10min即为工作液。

(18)细胞固定液配制：4％PFA多聚甲醛溶液购买自碧云天生物技术有限公司。

(19)qPCR引物：杭州尚亚生物技术有限公司合成，用DEPC水配成10mM浓度-20℃保存，引物序列如下：

Fabp4基因:F’:5′-GTCCT GGTACATGTGCAGAA-3′；

R’:5′-CTCTTGTAGAAGTCACGCCT-3′；

Adipoq基因:F’:5′-ATGACGACTGCCATCCTAGAG-3′；

R’:5′-GCTCCCTAAAGAGCTGGGG-3′；

Ucp1基因:F’:5′-GTGAACCCGACAACTTCCGAA-3′；

R’:5′-TGCCAGGCAAGCTGAAACTC-3′

β-actin基因:F’:5′-CAGATGCCACTACAGCACG-3′；

R’:5′-CCTGCCGCTGCCATAGAAG-3′

Ppara基因:F’:5′-CCCAAGGGAGGAATAGCTTCT-3′；

R’:5′-CTCTGCGATGCGGTTCCAA-3′

Pparg基因:F’:5′-CTTGGCTGCGCTTACGAAGA-3′；

R’:5′-GAAAGCTCGTCCACGTCAGAC-3′

Dio2基因:F’:5′-ATGGGACTCCTCAGCGTAGAC-3′；

R’:5′-ACTCTCCGCGAGTGGACTT-3′

Prdm16基因:F’:5′-CCACCAGCGAGGACTTCAC-3′；

R’:5′-GGAGGACTCTCGTAGCTCGAA-3′

PGC-1a基因:F’:5′-TATGGAGTGACATAGAGTGTGCT-3′；

R’:5′-GTCGCTACACCACTTCAATCC-3′

Cox7a1基因:F’:5′-GCTCTGGTCCGGTCTTTTAGC-3′；

R’:5′-GTACTGGGAGGTCATTGTCGG-3′

Elovl3基因:F’:5′-TTCTCACGCGGGTTAAAAATGG-3′；

R’:5′-GGCCAACAACGATGAGCAAC-3′

Tbx1基因:F’:5′-TCTCGCCTGCTTAACGTGG-3′；

R’:5′-CCAGCCCTGTGACACTAATCTT-3′

Slc27a1基因:F’:5′-CTGGGACTTCCGTGGACCT-3′；

R’:5′-TCTTGCAGACGATACGCAGAA-3′

CD40基因:F’:5′-TGTCATCTGTGAAAAGGTGGTC-3′；

R’:5′-ACTGGAGCAGCGGTGTTATG-3′

CITED1基因:F’:5′-ACTAGCTCCTCTGGATCGACA-3′；

R’:5′-GACCCAGTTTTGCATGGGC-3′

(20)Western blot实验：①细胞裂解液的配制：配制pH值为7.4的0.6％TritonX100 Tris-Hcl溶液并加入一定剂量蛋白酶体抑制剂。②抗体购买：β-Actin、CITED1、UCP1、Pparg、Ppargc1a、Fabp4、Adipoq等蛋白抗体购买自abclonal、CST公司。

以下，参照实施例对本发明进行更详细和具体地描述，但下述实施例并不意在限制本发明。

实施例1小鼠主动脉血管周围脂肪来源间充质前体干细胞的分离与培养

1)采集脂肪组织样品：用浓度为70ug/g戊巴比妥生理盐水溶液腹腔内注射6-8周龄雄性C57/BL小鼠实施安乐死。小鼠安乐死后用75％浓度酒精浸泡两分钟消毒并在无菌超净台进行解剖。解剖与采集器械全部消毒，解剖打开小鼠腹腔于体视镜下观察并采集胸、腹主动脉血管周围脂肪组织、以及用作对照的白色性腺附睾周围脂肪组织，分别收集到标记好的EP管中，并置于冰上。以五只小鼠作为一个组织样品，每个类别的组织样品大约50mg。

2)组织处理：无菌过滤添加双抗的pH值为7.4KRB缓冲溶液，于冰上用该缓冲液进行组织清洗，去除多余杂质后，无菌吸水纸吸干组织，机械剁碎成1-2mm组织小块。

3)酶解脂肪组织：以每50mg净重小鼠胸腹主动脉周围脂肪组织加入10mL预热0.1％I型胶原蛋白酶酶液比例进行酶解，混匀放置在37℃恒温转子上，混合均匀后37℃75rpm旋转孵育35分钟直至消化充分，每10min观察组织以免消化过度细胞活力下降；对照组：以每50mg净重小鼠白色附睾脂肪组织加入10mL预热0.05％I型胶原蛋白酶酶液比例进行酶解，混匀放置在37℃恒温转子上，混合均匀后37℃75rpm旋转孵育30分钟。

4)差速离心并提纯细胞：酶解消化结束后加入等体积10％FBS的DMEM高糖标准培养基终止消化，将混合液4℃500g转速离心5min。离心后剧烈涡旋混匀离心后的液体与沉淀，并再用相同方法离心细胞悬液，离心弃上清后得到大量脂肪来源间充质前体干细胞杂细胞团。杂细胞团加入红细胞裂解液破坏残留的血细胞，裂解数分钟后然后离心弃上清，加入新鲜培养基重新悬浮，在经过多次重复离心加入培养基重悬的操作后可获得纯度较高的间充质前体干细胞；

5)过滤细胞与培养：离心提纯的细胞团块重悬后分别用100um与40um细胞筛依次过滤，并将滤液离心。在离心完毕弃上清后，加入预热的新鲜培养基重悬细胞接种于0.1％明胶包被30分钟以上并预热的培养皿中，培养皿于37℃恒温5％二氧化碳浓度饱和湿度细胞培养箱中培养。培养传代后的细胞形态如附图1所示。

实施例2小鼠主动脉血管周围脂肪来源间充质前体干细胞的细胞表面标志的分选与鉴定

1)流式细胞术细胞分选：扩大培养小鼠胸、腹主动脉血管周围脂肪来源间充质前体干细胞，待其长满后PBS洗涤细胞两次0.05％胰酶消化数分钟，4℃1000rpm离心5min，弃上清加1ml PBS重悬分装于1.5ml离心管中。4℃1000rpm离心5min后弃上清，加入100μl流式Buffer(PBS+2％FBS)。

根据文献选择小鼠主动脉血管周围脂肪来源间充质前体干细胞的表面标记物。每管细胞分别加入5μl抗体混匀：CD34-FITC(造血干细胞标记)、CD45-FITC(造血干细胞标记)、CD19-FITC(淋巴B细胞标记)、CD31-FITC(内皮细胞标记)、CD90-PE(间充质干细胞标记)、CD73-APC(脂肪来源间充质干细胞标记)、CD146-Alexa Fluor 647(脂肪来源间充质干细胞标记)、PDGFRa-Pacific blue 450(tPVAT脂肪来源间充质干细胞标记)与SM22a-PE-Cy7(aPVAT脂肪来源间充质干细胞标记)；设置空白对照与同型对照处理组(同型对照抗体为mouse IgG FITC、PE、APC、AF647、PB450与PE-Cy7)。待抗体加入细胞并混匀后，4℃避光孵育30min，1000rpm离心细胞悬液5min，弃上清加入1ml PBS清洗一次，立即用流式细胞仪进行细胞分选。

2)流式细胞术鉴定细胞表面标志蛋白鉴定：与上述步骤相同，收集细胞并加入相应表面标记物抗体，PBS洗涤细胞，加入500μl含1％多聚甲醛的PBS溶液混匀于4℃避光放置，24小时内用流式细胞仪检测细胞荧光强度。流式分析实验中，每份样品采集的细胞数≥10

流式分析仪鉴定结果显示，经过本发明针对小鼠主动脉血管周围脂肪组织进行分离间充质前体干细胞与流式分选后，得到纯度较高的脂肪来源的间充质干细胞群，并且其中造血干细胞、巨噬细胞、内皮细胞、粒细胞和淋巴细胞等免疫细胞群减少到流式检测不到的水平。

实施例3小鼠主动脉血管周围脂肪来源间充质前体干细胞的扩培与冻存

1)扩大培养：在P0代原代细胞培养贴壁一天后将皿中培养液全量换掉。用PBS溶液洗涤两遍去除未贴壁细胞与杂质并加入新鲜培养基。待细胞全部长满后，进行细胞传代扩培。10cm dish的原代细胞经过PBS洗涤后加入2ml0.05％胰酶37℃消化原代细胞6分钟。镜下观察，细胞变圆且平面晃动平皿时细胞全变为悬浮状态时加等量新鲜培养基终止消化。用微量移液器按同一方向将培养皿上的细胞吹下，移入15ml离心管，500g离心5min后离心吸弃上层液体，再重新加入新鲜培养基混匀重悬进行细胞计数，按5×10

2)原代细胞活力及内毒素检测：原代脂肪间充质干细胞扩培后胰酶消化收集，将离心后的上清取部分用做细胞内毒素的检测；收集的细胞沉淀用培养液适量重悬，进行细胞量和细胞活力检测；

3)传代冻存：将流式检测细胞表面标记鉴定正确，并且活力与内毒素检测合格的原代脂肪间充质干细胞以7×10

①诱导成脂分化方案：

1)细胞铺板：小鼠主动脉血管周围脂肪来源和附睾周围脂肪来源的间充质前体干细胞以1×10

2)诱导成脂分化与维持分化培养基的使用方案：为了更贴合小鼠主动脉血管周围脂肪组织的特性及表型，本发明在鸡尾酒法分化方案基础上尝试新的配比及成脂分化刺激物，并配制胸、腹主动脉周围脂肪棕、米色脂肪诱导成脂分化及维持分化培养基，附睾白色脂肪诱导成脂分化及维持分化培养基。在原代脂肪间充质干细胞铺板培养2天接触抑制2天后，加入不同类型脂肪的诱导成脂分化培养基培养4天，显微镜下观察细胞形态，当观察到细胞形态正常并且微小脂滴出现并位于细胞胞浆内时，加入相应类型脂肪的维持分化培养基4-6天，以上步骤均两天全量更换相应培养液，等待分化完全后进行鉴定与检测。诱导成脂分化培养基加入细胞培养不得超过4天以上，维持分化培养基加入细胞培养不可超过6天以上，否则分化细胞状态变差容易漂浮。分化后期成熟脂肪细胞变多后，细胞层容易打卷、漂起来，造成样品损失，换液时需轻柔，吸走旧培液时要轻并慢，避免枪头直接触碰细胞层；加入新鲜培液时用移液器从侧壁缓慢将液滴加入，防止液体直接冲击细胞层。不同时期分化结果细胞形态如附图3所示。

②成脂分化相关鉴定

1)油红O染色细胞形态鉴定：PBS清洗两遍分化完毕后的不同种类脂肪组织来源的原代细胞，用4％PFA原位固定细胞15min，用油红O染色工作液37℃染色细胞30min，用60％异丙醇溶液洗涤细胞1s，脱去多余颜色，双蒸水清洗细胞数次并液封，显微镜下观察细胞形态进行细胞表型鉴定。在加入诱导分化培养基4天以后就可以观察到细胞内油滴的生成，并且持续加入诱导分化培养基细胞内油滴增多。根据细胞胞浆内油滴的大小分布可以对不同类型脂肪细胞进行表型鉴定，分化后的成熟白色脂肪细胞含有许多体积较大的单房脂滴，细胞呈多边形，细胞核位于细胞的边缘，并含有少量的线粒体。白色脂肪细胞的脂肪油滴呈单房并且油滴体积较大，而棕色或米色脂肪细胞含有多房小脂滴，分布细胞胞浆内各个地方，富含线粒体。不同类型脂肪来源的原代间充质前体干细胞分化后的油红O染色细胞表型结果如附图4所示。

2)qPCR法检测成脂分化相关蛋白标志物的转录水平：将分化前后的小鼠原代脂肪来源间充质前体干细胞先用PBS冲洗两遍，用盐离子吸附柱法提取RNA试剂盒提取原代细胞总RNA。用通用反转录试剂盒反转录RNA成cDNA，并设计成脂相关基因特异性引物，然后用实时定量荧光PCR试剂盒检测分化后原代细胞成脂相关基因的转录mRNA水平，以β-actin作为内参。结果如附图5所示。

3)Western blot蛋白质印迹法检测成脂分化相关蛋白标志物表达水平：将分化前后的小鼠原代脂肪来源间充质前体干细胞用PBS冲洗两遍，用胰酶消化收集后离心弃去上清，收集细胞沉淀，用细胞裂解液裂解细胞同时用超声仪破碎细胞，离心收集上清即为细胞总蛋白裂解液。向蛋白裂解液中加入适量的SDS-PAGE上样缓冲液，并在金属浴中100℃加热5分钟，所获WB蛋白样品，加到SDS-PAGE凝胶上，进行Western blot蛋白质印迹实验，检测分化后原代细胞成脂相关基因的蛋白表达水平。WB实验主要对PPARy、Adiponectin、PGC1-α、Ucp1、Tbx1、Slc27a1等关键蛋白进行检测，并对比白色脂肪来源间细胞分化相应关键蛋白形成结果，结果如附图6所示。

结果表明无论在转录水平还是蛋白表达水平，当脂肪来源间充质前体干细胞向白色脂肪方向分化时，细胞高表达PPARa、PPARy、Adiponectin、Fabp4等成脂分化标志基因；而向棕色或米色脂肪方向分化时，除了高表达上述成熟脂肪基因之外，还额外高表达Dio2、Prdm16、PGC1-α、Elovl3、Cox7a1和Ucp1等棕色脂肪标志基因，或Tbx1、Slc27a1、CD40、CD137及CITED1等米色脂肪标志基因。

本发明首次公开了小鼠主动脉血管周围脂肪来源间充质前体干细胞的分离与分化方案，方案中简化了组织酶解方案，操作生产工艺，提高了原代细胞的产量、纯度、细胞活性，保留了其异质性与解剖学特殊性，满足了临床研究与工业化生产需要，并有效降低小鼠原代脂肪来源间充质前体干细胞的制作工艺的成本。并且，本发明首次公开了针对小鼠主动脉血管周围脂肪来源间充质前体干细胞的高诱导成脂分化率的分化方案，经分化后的细胞保留了小鼠主动脉血管周围脂肪组织的解剖学特性与异质性，为研究筛选潜在治疗心血管疾病药物小分子靶点与血管病理临床研究提供相应的技术支持。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细。实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。本发明的说明是说明性的而非限制性的，本领域的技术人员可以在不脱离本发明原理的前提下轻易的做出改进和修饰，但这些改进和修饰也都落入本发明权利要求保护的范围内。