布鲁氏菌病CF-ELISA抗体检测试剂盒

摘要

本发明公开了布鲁氏菌病CF‑ELISA抗体检测试剂盒，属于布鲁氏菌病CF‑ELISA检测领域，包括壳体，壳体内装有检测盒和底片，检测盒的顶部开设有观察口，观察口的内部设有前置检测线条，观察口的内部靠近前置检测线条的一侧设有后置检测线条，观察口的内部靠近后置检测线条的一侧设有品控线，检测盒顶端的一侧开设有放样口，放样口内插入有取样管，本发明提供的布鲁氏菌病CF‑ELISA抗体检测试剂盒，利用免疫层析技术，对样本实现快速检测，具有灵敏度高和耗时短的优点，同时利用间接免疫荧光检验的方法来进行辅助检测，比直接法敏感度提高5‑10倍，一种荧光二抗可检测多种抗原抗体系统，制备方法简单，成本低廉，易于进行商业化生产。

说明书

技术领域

本发明属于布鲁氏菌病CF-ELISA检测领域，具体涉及布鲁氏菌病CF-ELISA抗体检测试剂盒。

背景技术

接触性布鲁菌病，是指一种由布鲁氏菌引起的疾病，首发症状通常为急性发热，极少或不伴头痛、关节疼痛等局部症状，该病可进展至慢性期，会出现反复发热、盗汗、乏力、酸困、疼痛的症状，该病的患病情况如何从全球范围来看，超过100个国家有接触性布鲁菌病报告，母年报告新友两例约5U力例，主要出现在西北、东北、青藏高原及内蒙古等牧区，已成为重要的公共卫生问题，该病根据致病病原体不同，可分为牛流产布鲁菌致人布鲁菌病、羊流产布鲁菌致人布鲁菌病、猪流产布鲁菌致人布鲁菌病和犬布鲁菌致人布鲁菌病。

现有的布鲁菌病检测方式主要是依靠胶体金免疫层析检测试剂盒检测，但是现有的胶体金免疫层析检测试剂盒灵敏度较低，稳定性也不够，而且耗时长，其次现有的检测方法步骤杂乱容易出现假阳性的结果，造成后续不适当的治疗，同时所需的检查设备成本较高，不适用与小型研究所或者小型医院，所以需要一种新型的并且较为全面的检测方法来解决此问题。

发明内容

为了克服现有技术中的上述不足，本发明的目的之一在于布鲁氏菌病CF-ELISA抗体检测试剂盒，可以实现对猪羊粪便或呕吐物样本中的布鲁氏菌病毒快速检测，检测灵敏度高，稳定性好，不容易出现假阳性。

本发明的目的之二在于提供一种布鲁氏菌病检测试剂盒，对布鲁氏菌病毒检测特异性高，不容易出现假阳性。

本发明的目的之三在于提供一种布鲁氏菌病检测试剂盒的制备方法。

本发明的目的之四在于提供一种布鲁氏菌病检测试剂盒的使用方法，可以在仅需一次取样条件下，完成布鲁氏菌病毒的检测，极大地方便了动物检疫人员，且特异性及灵敏度较好。

本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种检测布鲁氏菌病的引物，包括病原体所述提取布鲁氏菌病的cDNA为模板，SAGL-F、SAGL-R为上下游引物，对SAGL基因进行PCR扩增；

上游引物：PDCoV-F：5’-TCGGATCCCCCTCTTGTTGC-3’

下游引物：PDCoV-F：5’-AGCCGATTTTGCTGACCCTG-3’

所述扩增的布鲁氏菌病毒基因目的片段为359bq。

进一步地，包括壳体和恒温收集箱，所述恒温收集箱的内部开设有卡槽，所述卡槽和壳体相互适配，所述恒温收集箱的顶部合页连接有箱盖，所述壳体内装有检测盒和底片，所述检测盒的顶部开设有观察口，所述观察口的内部设有前置检测线条，所述观察口的内部靠近前置检测线条的一侧设有后置检测线条，所述观察口的内部靠近后置检测线条的一侧设有品控线，所述检测盒顶端的一侧开设有放样口，所述放样口内插入有取样管。

进一步地，所述底片的顶部设有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜顶部的结构和观察口内的结构相同，所述硝酸纤维素膜的一侧设有护纸层，所述硝酸纤维素膜的另一侧设有金标垫，所述金标垫的一侧设有边垫。

进一步地，所述具体使用步骤如下：

S1、采用胶体金标记布鲁氏菌病单克隆抗体，得到所述胶体金标记的布鲁氏菌病抗体；将胶体金标记的布鲁氏菌病抗体，喷涂在所述金标垫上；

S2、将胶体金标记的布鲁氏菌病抗体包被在硝酸纤维素膜上，形成前置检测线条，将羊抗鼠IgG包被在位于所述前置检测线条另一侧的硝酸纤维素膜上，形成品控线，且进行干燥处理；

S3、在底片上分别顺次搭接对应的边垫、金标垫、硝酸纤维素膜和护纸层，组成对应的板后，切成布鲁氏菌病检测试纸条；

S4、将制得的布鲁氏菌病检测试纸条装进塑料壳体中，调整布鲁氏菌病检测试纸条的位置，使放样口在边垫上方，观察口在前置检测线条、后置检测线条以及品控线上方，即得布鲁氏菌病检测盒；

S5、将S4中制备的布鲁氏菌病检测盒和样本稀释液置于壳体中，得到布鲁氏菌病检测试剂盒。

进一步地，所述所需的仪器设备如下：

低温冰箱、制冰设备、水平摇床、离心机、振荡器、杀菌器、干燥箱、凝胶成像设备、核酸电泳仪、荧光显微镜。

进一步地，所述所需材料如下：

氨苄青霉素、DMEM、彩色预染蛋白Marker、Trypsin-EDTA、卡那霉素(Kan)、蛋白酶抑制剂、单片段同源重组酶、DNA Marker、PVDF膜、核酸染料以及无水乙醇、氯化钠、氯化钾、甲醇。

进一步地，所述试剂的配制方法如下：

S1、称量2gNaCl，2gTryptone，1gYeastExtract，先用称量容器量取150mL，去离子水，完全溶解后定隔至200mL，温度要保证在121℃，杀菌15min，称量2gNaCl，2gTryptone，1gYeast Extract，3gAgar powder,先用称量容器量取150mL去离子水，完全溶解后定隔至200mL，同样温度保证121℃，杀菌15min，杀菌结束后使其降温至50℃倒板，将固体板放于4℃冰箱保存；

S2、分别称取NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4置于烧杯中，量取去离子水900mL，将称取得药品和去离子水混合，放置于磁力搅拌器，进行搅拌使试剂充分溶解，将pH调至7.4，然后将溶液定隔至1L，倒入洁净的试剂瓶中，进行高压杀菌后备用，称量Tris、Glycine、SDS三种试剂，加入约800mL的去离子水，搅拌使试剂完全溶解，最后加去离子水将溶液定隔至1L，室温保存备用，在4.196mL杀菌后的蒸馏水中加入1g IPTG搅拌溶解，用0.22μm的滤膜除菌，分装到2mLEP管中，终浓度为1M，且储存于-20℃冰箱备用；

S3.称量242g Tris，37.2g Na2EDTA.2H20倒入1L体积烧杯中，完全溶解后,加入57.1mL HAC定隔至1L，室温保存,称量0.3g琼脂糖粉末倒入锥形瓶中，加入1mL 50×TAEBuffer，量取29mL去离子水加入锥形瓶中，至于微波炉中加热至胶完全溶解,放凉至加入5μL核酸染色剂，摇匀后倒入插好梳子的胶托内，室温凝固30min后使用,称量1g考马斯亮蓝R-250倒入300mL去离子水中，分别量取100mL冰醋酸，250mL甘油倒入烧杯中，完全溶解后，定隔至1L，利用滤纸过滤,后室温保存；

S4.用称量容器量取500mL甲醇倒入1L体积烧杯中，加入100mL冰醋酸，定隔至1L，室温保存，称量8.8g NaCl倒入1L体积烧杯中，量取20mL 1MpH＝8.0的TrisHCl，吸取0.5mLTween-20，分别加入烧杯中，完全溶解后，定隔至1L，室温保存，称量0.5g脱脂奶粉倒入15mL离心管内，吸取10mL TBST Buffer于离心管使其溶解，现用现配，称量0.22g NaCl倒入15mL离心管内，吸取10μL PMSF加入离心管内，先加入8mL 1×PBS使其完全溶解，定隔至10mL，称量0.22g NaCl倒入15mL离心管内，吸取10μL PMSF加入离心管内，先加入8mL 1×PBS使其完全溶解，定隔至10mL，称量0.61464g谷胱甘肽(还原型)倒入15mL离心管内，吸取10μLPMSF加入离心管内，先加入8mL 1×PBS使其完全溶解，定隔至10mL，现用现配；

S5.用称量容器量取22.2mL硫酸溶液倒入177.8mL体积的去离子水中，室温保存,称量2.93g NaHCO3，1.59g Na2CO3，溶解在900mL蒸馏水的烧杯中，完全溶解后，室温保存,将配好的0.01M PBS缓冲溶液放于烧杯中，吸取0.5mL Tween-20，搅拌使试剂完全溶解，定隔至1L，倒入干净的广口瓶中，现配现用。

本发明的检测原理：

检测阳性样本时，样品中含有的布鲁氏菌病毒，可与金标垫上胶体金标记的布鲁氏菌病毒单克隆抗体结合形成复合物，该复合物在前置检测线条处和布鲁氏菌病毒多克隆抗体汇合被前置检测线条捕获，从而相应凝集显色；金标垫上未结合胶体金标记的布鲁氏菌病毒单克隆抗体与品控线处包被的羊抗鼠IgG结合而凝集显色，检测阴性样本时，样本中布鲁氏菌病毒，不能形成免疫复合物，则只能在品控线处显色，因此，无论布鲁氏菌病毒是否存在于临床样本中，一条红色条带都会出现在品控线处。

利用间接免疫荧光检验的方法检测时是用特异性抗体与标本中相应抗原反应后，再用荧光素标记的第二抗体(抗抗体)与抗原-抗体复合物中第一抗体结合，洗涤后在荧光显微镜下观察特异性荧光，以检测未知抗原或抗体。

与现有技术相，本发明具有的有益效果如下：

(1)本发明提供的布鲁氏菌病CF-ELISA抗体检测试剂盒，利用免疫层析技术，对样本实现快速检测，具有灵敏度高和耗时短的优点，对标记物垫用NaCl溶液进行前处理，能有效消除免疫层析试纸的假阳性，可以提高检测结果的稳定性，和猪血清白蛋白组合可以改善样本的离子环境，有良好稳定胶体金溶液的效果，不需要过多的精密仪器，很多小型研究所和小型医院也可以使用。

(2)本发明提供了一种间接免疫荧光检验的方法来进行检测，比直接法敏感度提高5-10倍，且一种荧光二抗可检测多种抗原抗体系统，制备方法简单，成本低廉，易于进行商业化生产。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是用本申请实施例2提供的恒温收集箱的结构示意图。

图2是用本申请实施例2提供的套壳结构图。

图3是本申请实施例2的检测盒结构图。

图4是本申请实施例2的检测盒侧视图。

图5是本申请实施例2的底部结构图。

图中：1、壳体；2、检测盒；3、底片；4、观察口；5、前置检测线条；6、后置检测线条；7、品控线；8、取样管；9、放样口；10、边垫；11、护纸层；12、金标垫；13、硝酸纤维素膜；14、套壳；15、边盖；16、恒温收集箱；17、卡槽；18、箱盖。

具体实施方式

为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下将结合实施例对本申请的技术方案进行清楚、完整的描述。应当理解此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

所用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供一种检测布鲁氏菌病的引物，请参阅附图4，包括病原体，提取布鲁氏菌病的cDNA为模板，SAGL-F、SAGL-R为上下游引物，对SAGL基因进行PCR扩增；

上游引物：PDCoV-F：5’-TCGGATCCCCCTCTTGTTGC-3’

下游引物：PDCoV-F：5’-AGCCGATTTTGCTGACCCTG-3’

扩增的布鲁氏菌病毒基因目的片段为359bq，提取布鲁氏菌病的cDNA为模板，SAG1-F、SAG1-R为上下游引物，对SAG1基因进行PCR扩增，加样结束后，瞬离5s以确保样品完全沉于管底，离心后放入PCR仪内进行扩增，在4℃的温度下可进行短时间保存，时间久会对仪器造成损耗，反应结束后应尽快拿出反应产物，扩增时间因酶的不同、基因长度的不同而长短不一，需要说明的有引物的扩增是制备抗体最重要的一个步骤，如果需要对扩增产物进行检测，可以取扩增产物5μL,通过琼脂糖凝胶电泳，加入EB染色剂，在应用凝胶成像系统下观察结果，在实际操作中，先准备灭菌的移液器吸头、牙签或混匀棒、计时器和洁净的玻璃板，并在玻璃板上划分出两个4cm

实施例2

本实施例提供布鲁氏菌病CF-ELISA抗体检测试剂盒，请参阅附图1-3，包括壳体1，壳体1内装有检测盒2和底片3，检测盒2的顶部开设有观察口4，观察口4的内部设有前置检测线条5，观察口4的内部靠近前置检测线条5的一侧设有后置检测线条6，观察口4的内部靠近后置检测线条6的一侧设有品控线7，检测盒2顶端的一侧开设有放样口9，放样口9内插入有取样管8，底片3的顶部设有硝酸纤维素膜13，硝酸纤维素膜13顶部的结构和观察口4内的结构相同，硝酸纤维素膜13的一侧设有护纸层11，硝酸纤维素膜13的另一侧设有金标垫12，金标垫12的一侧设有边垫10，选取样本时可以从仔猪、育肥猪、母猪以及母乳期母猪中挑选，可以选用呕吐物、粪便以及内脏血清，具体用试剂盒检测的步骤如下：用棉签采集排泄的粪便、呕吐物或者直接从直肠取得的样本，然后将立即将棉签插入装有样本稀释液的样品管中，取出棉签后用力摇晃使之充分混匀，得到待测样本溶液，静置数分钟后待测、放置好检测盒2，使之水平放置于操作平台上，用取样管8吸取待测样本溶液3～4滴(约100μL)滴加到放样口9中，5～10分钟内观察并判读结果，超过15分钟的结果无效，原理主要是通过观察样本的颜色变化来判定，其中后置检测线条6和前置检测线条5的作用是相同的，是备用的，防止某个检测线在待检测时出现掉色的情况，其次前置检测线条5和后置检测线条6的外部都包裹有防护贴纸，用以防止前置检测线条5或者后置检测线条6失效，使用哪一条检测线就撕掉哪一条检测线的防护贴纸，设备中的套壳14用于保护整个检测盒2，恒温收集箱16便于对检测盒2内的检测样本进行恒温保存。

实施例3

本实施例提供一种检测布鲁氏菌病的方法，除了利用试剂盒也可以通过荧光抗体对比的方法，将洁净的盖玻片置于100％酒精和去离子水中冲洗，晾干备用，纯化虫株，PBS洗涤2次后重悬，吸取适量的速殖子滴于干净的盖玻片上涂抹均匀后，静置3min，吸弃表面的液体，在铺有速殖子的玻片上缓慢滴加4％多聚甲醛数滴，室温静置30min，再用用PBS溶液进行玻片的清洗，每次5min，洗3次，用PBS配制0.25％ Tritonx-100溶液，滴于玻片上，室温作用20min，PBS清洗1次，每次5min，用PBS配制3％ BSA溶液，滴于玻片上，室温作用30min，用抗体稀释液(3％ BSA溶液)将猪的血清稀释(1:150)，滴于玻片表面与速殖子孵育，放置37℃恒温箱，1h孵育结束后，用PBS清洗3次，每次5min用抗体稀释液将FITC(绿光)标记的抗猪二抗抗体稀释，比例为1:100后滴于玻片表面进行孵育，放置37℃恒温箱，1h孵育结束后，用PBS清洗3次，每次5min在干净的载玻片上滴加适量的荧光淬灭剂，将载玻片倒置于载玻片，避免产生气泡，用封片剂将盖玻片边缘密封，此步骤要避光操作，每个载玻片上做好对应的标记，放置在切片盒内，避光4℃保存，在荧光显微镜下观察，以猪的阳性、阴性血清样本作为参考指标，判断待检猪血清样本的阴性、阳性，记录数据并拍照保存，通过这种检测方法可以对试剂盒检测的样本重新抽样检验，减小可能存在的失误，也就是用于辅助试剂盒。