脂筏特征蛋白作为生物标志物在诊断乳腺癌中的应用

摘要

本发明涉及一种脂筏特征蛋白作为生物标志物在诊断乳腺癌中的应用，涉及液体活检技术领域。本发明提供了生物样本中脂筏特征蛋白作为生物标志物在诊断乳腺癌中的应用，脂筏特征蛋白为Flot2，通过检测该生物标志物的表达水平，能够判断生物样本的受试者是否患有乳腺癌，或者判断受试者是否存在患有乳腺癌的风险，有助于对新发乳腺癌进行早期筛查，利于临床医生迅速掌握患者病情。

说明书

技术领域

本发明涉及液体活检技术领域，特别是涉及一种脂筏特征蛋白作为生物标志物在诊断乳腺癌中的应用。

背景技术

乳腺癌是女性人群中最常见的恶性肿瘤之一，发病率占所有肿瘤的23％。全球每年新发病例达160万例，是全球女性死亡最多的第二大癌症。乳腺癌诊治的关键在于早发现、早诊断和早治疗。在早期发现乳腺癌并及时进行治疗可增加乳腺癌患者的治愈率及保乳、保腋的机会，提高患者的生活质量。然而，尽管现今筛查方案和辅助疗法的发展取得了成功，但仍有相当大比例的乳腺癌患者死于癌症转移。

目前针对乳腺癌的早期筛查包括体格检查、影像学检查、乳腺导管镜检查、活检及液体检测等方法。定期接受临床体格检查是早期发现乳腺癌的有效方法之一，但由于乳腺癌普查耗资巨大，因此乳腺癌早期发现主要着眼于患者自我检查偶尔触及肿块而就诊，但此时往往已过疾病最佳治疗期。

影响学检查包括钼靶X线摄片、超乳腺超声和乳腺磁共振等检测手段。乳腺X线检查对年轻致密乳腺组织穿透力差，适用于40岁以上且存在明确乳腺癌高危因素或临床体检已发现异常的妇女，而对于致密型乳腺内的病变及近胸壁的病变易漏诊。乳腺超声检查需要依靠超声医师的经验，具有较强的主观性，故不做为乳腺癌早期主要的筛查方法。MRI筛查活检率较高，但肿瘤检出率较低，与接受单纯乳腺钼靶X线筛查相比有较高的活检率，但MRI筛查的优势人群还需明确。乳腺癌早期诊断建议结合超声、MRI和病理检查，但由于特殊仪器的限制及诊断技术昂贵的价格，在发展中国家及地区得不到广泛应用。

乳腺导管镜检查及活检属于有创性操作，前者能直观观察到乳腺管内的病变，对于早期导管癌有一定的诊断价值，但可能造成乳腺管的损伤及感染，此外导管外乳腺癌确诊受限；乳腺穿刺活检可能导致穿刺部位疼痛、出血、感染或者癌细胞的扩散转移，准确率相对较低，而且存在上皮移位。因此在乳腺癌的早期筛查领域，仍需要更便捷、准确、安全的检测方法问世。

近年来，生物靶标检测在乳腺癌早期检测中诞生且发展迅速，比如乳腺癌相关基因普查、乳头溢液特异物检测、血清肿瘤标志物的测定及液体活检等方法。此外对乳腺癌病人血液或其他体液进行末梢循环血中癌细胞计数、ctDNA及外泌体检测也可用于乳腺癌病理分类、恶性程度及预后的评估。由于液体检测具有无创、快捷、准确率高等传统检测方法所不具备的优势，逐渐成为乳腺癌早期筛查的研究热点。液体检测虽然具有敏感人群的选择、高昂费用及预测的实际效果有待临床的深入验证等问题，但也为乳腺癌早期筛查带来新的思路和曙光。

发明内容

针对上述问题，本发明提供脂筏特征蛋白作为生物标志物在诊断乳腺癌中的应用，能够判断生物样本的受试者是否患有乳腺癌，或者判断受试者是否存在患有乳腺癌的风险，有助于对新发乳腺癌进行早期筛查，利于临床医生迅速掌握患者病情。

为了达到上述目的，本发明提供了生物样本中脂筏特征蛋白作为生物标志物在诊断乳腺癌中的应用，所述脂筏特征蛋白为Flot2。

Flot2作为一种重要的脂筏内蛋白，能参与调节多个细胞过程如膜受体介导的信号通路、神经细胞轴突再生、T细胞活化、肿瘤细胞生长、迁移等。单核细胞，包括经典单核细胞、非经典单核细胞及中间单核细胞，约占血液中白细胞10％，能吞噬、清除损伤和老化的细胞及碎片、参与机体的免疫反应、识别杀死乳腺癌等肿瘤细胞。CD14

本发明还提供了生物样本中脂筏特征蛋白作为生物标志物在开发和/或制备用于乳腺癌的诊断用途的产品中的应用，所述脂筏特征蛋白为Flot2。

在其中一个实施例中，所述脂筏特征蛋白为CD14

在其中一个实施例中，所述脂筏特征蛋白为CD14

在其中一个实施例中，所述应用包括以下步骤：获取待评估对象的生物样本，裂解红细胞，将剩余细胞通过流式细胞技术或微流控芯片检测单核细胞及脂筏特征蛋白的表达；当脂筏特征蛋白表达水平高时，则提示所述待评估对象乳腺癌风险高。

上述检测方法便捷、检测周期明显缩短、检测成本明显降低；其无需富集、分选单核细胞，且只需要100-200μl生物样本即可完成检测，检测成本更低。

在其中一个实施例中，所述应用包括以下步骤：

富集单核细胞：获取待评估对象的生物样本，采用富集试剂富集生物样本中的单核细胞，采用分选试剂分离得到单核细胞；

固定、染色单核细胞：采用细胞固定液将单核细胞固定，破膜，与识别所述脂筏特征蛋白的抗体孵育，采用细胞核染色剂进行染色，检测脂筏特征蛋白的表达；当脂筏特征蛋白表达水平高时，则提示所述待评估对象乳腺癌风险高。

通过上述方法，经过免疫荧光染色后的CD14

本发明还提供了一种用于乳腺癌的诊断用途的试剂盒，该试剂盒包括：用于检测生物样本中所述脂筏特征蛋白表达水平的试剂；所述试剂包括：富集试剂，分选试剂，识别所述脂筏特征蛋白的抗体。

采用上述试剂盒对乳腺癌进行检测，操作较简单且无需活检，检测结果灵敏度较高、荧光强度较强、对乳腺癌检测具有一定的预见性。

在其中一个实施例中，所述富集试剂为淋巴细胞分离液，所述分选试剂为人单核细胞分选试剂。

上述淋巴细胞分离液用于去除红细胞和白细胞的干扰；上述人单核细胞分选试剂用于去除非单核细胞以外的其他细胞以及血小板。

在其中一个实施例中，所述识别脂筏特征蛋白的抗体包括：Flot2特异性抗体，或Flot2特异性荧光抗体。

在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括：细胞固定液，细胞核染色剂，生物缓冲液；所述生物缓冲液包括表面活性剂。

在其中一个实施例中，所述细胞核染色剂包括Alexa488染色剂和/或DAPI染色剂，所述表面活性剂为Triton X-100或SDS。

在其中一个实施例中，所述表面活性剂为Triton X-100，所述生物缓冲液中Triton X-100的质量百分数为0.1％-0.5％。

在其中一个实施例中，所述生物缓冲液为PBS缓冲液。

在其中一个实施例中，所述PBS缓冲液为0.01M的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液中的Na

在其中一个实施例中，所述生物样本为外周血。

在其中一个实施例中，所述细胞固定液包括以下原料中的至少1种：多聚甲醛，戊二醛，福尔马林，乙醇，或丙酮。

本发明还提供了一种用于诊断乳腺癌的系统，该系统包括：

分析装置：用于检测待诊断对象生物样本中所述脂筏特征蛋白的表达水平，输入评估模型进行诊断分析；

输出装置：用于输出上述诊断结果。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的脂筏特征蛋白作为生物标志物在诊断乳腺癌中的应用，能够判断生物样本的受试者是否患有乳腺癌，或者判断受试者是否存在患有乳腺癌的风险，有助于对新发乳腺癌进行早期筛查，利于临床医生迅速掌握患者病情。且与乳头溢液特异物检测、血清肿瘤标志物的测定、末梢循环血中癌细胞计数等现有液体活检方法相比，本发明的试剂盒利用流式细胞技术、免疫荧光染色技术，采用流式细胞仪、成像流式细胞仪及倒置激光共聚焦显微镜等设备，可有效地富集CD14

附图说明

图1为实施例中的镜检结果；

图2为实施例中的荧光强度的统计结果；

其中1为健康人，2为良性肿瘤患者，3为早期乳腺癌患者。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

来源：

淋巴细胞分离液(购自达科为公司)，人单核细胞分选试剂(Stemcell的EasySep

本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明，均为市售来源；实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规实验方法。

实施例

一、富集外周血中经典CD14

1、获取健康人、良性肿瘤患者、新发乳腺癌患者(早期乳腺癌患者)的外周血，将外周血静置30分钟后吸去血清，而后血浆中加入等量PBS缓冲液和淋巴细胞分离液，在离心机中以450g离心力，常温离心30min。离心后分为三层，底层为红细胞层，略带白色的中间层主要为白细胞，黄色的上层为血浆，吸取中间层的白细胞。

2、向步骤1得到的细胞加入人单核细胞分选试剂，使用磁极负选得到CD14

3、将目的细胞铺于玻片上，而后使用4％多聚甲醛将细胞固定于玻片中；

4、细胞破膜：细胞固定后在载玻片上细胞区域滴加0.5％的Triton X-100细胞破膜液(表面活性剂)，孵育5min后加PBS缓冲液清洗玻片2次，每次5min。

5、Flot2的免疫荧光染色：细胞区域使用1：(100～200)的Flot2抗体孵育2h后加PBS缓冲液清洗玻片3次，每次5min。后使用1：(500～1000)Alexa488避光孵育2h后加PBS缓冲液清洗玻片3次，每次5min。

6、DAPI封片及镜检：吸去PBS缓冲液，使用2μg/ml的DAPI避光孵育3min后，吸去上清并滴入10μL封片剂封片并盖上盖玻片。使用蔡司共聚焦显微镜进行镜检，镜检条件为：激发光波长为499nm时Alexa488发射光为519nm绿光，曝光时间100ms；激发光波长为345nm时DAPI发射光为455nm蓝光，曝光时间10～20ms。

二、结果分析。

镜检结果如图1所示，荧光强度的统计结果如图2所示。

结果显示，健康人的外周血分离的CD14

从上述结果中可以看出，利用本发明的生物标志以及试剂盒，通过流式细胞技术、免疫荧光染色技术，采用流式细胞仪、成像流式细胞仪及倒置激光共聚焦显微镜等设备，可有效地富集CD14

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。