一种松果菊苷在制备治疗抗生素相关性腹泻药物中的应用

摘要

本发明提供了一种松果菊苷在制备治疗抗生素相关性腹泻药物中的应用，涉及生物医药技术领域。本发明所述松果菊苷提取自肉苁蓉，为药食同源物质，对人体没有任何不良反应。经试验证实可知，利用松果菊苷治疗发生抗生素相关性腹泻的小鼠后，小鼠的体重恢复，肠道炎症消失，腹泻症状明显改善；同时小鼠肠道菌群丰度和多样性恢复至正常水平，肠道菌群结构得到良性调整，表明所述松果菊苷可以通过调整肠道菌群紊乱治疗抗生素相关性腹泻，具有良好的应用和商业开发价值。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种松果菊苷在制备治疗抗生素相关性腹泻药物中的应用。

背景技术

人体肠道微生物是一个多元化的微生态系统，包含了大约100万亿个古生菌和细菌细胞，它们属于1000多个物种，其中厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门占90％以上。肠道菌群及其代谢物参与了人体自出生直至衰亡的生命代谢过程，在免疫、代谢、内分泌等方面发挥着重要的作用，与人体的健康和疾病的发展密切相关。研究证实，宿主的遗传因素、饮食习惯、环境因素、抗生素使用和慢性病治疗等都有可能破坏人体肠道菌群稳态，导致肠道菌群紊乱，且肠道菌群紊乱与多种疾病有着密切的联系，包括炎症性肠病、腹泻、便秘、高血压病、II型糖尿病，甚至心血管疾病、自闭症、帕金森病、免疫类疾病等。因此，肠道菌群被认为是多种疾病的可能治疗靶标。

抗生素相关性腹泻(Antibiotic－Associated Diarrhea，AAD)是指伴随着抗生素的使用而发生且无法用其他原因解释的腹泻，严重者可引起艰难梭菌感染，继而引发伪膜性肠炎，甚至危及生命。几乎所有抗生素都会引起腹泻，常见的药物包括青霉素类、头孢菌素类和林可霉素类等。目前认为，引起AAD的主要原因是抗生素的使用破坏了宿主正常的肠道菌群，尽管抗生素相关腹泻短时间内得到了治疗，但其对肠道菌群的影响持续存在。

目前，关于抗生素所致肠道菌群紊乱的治疗方法主要包括西医的抗生素治疗、中医药治疗、食用益生菌以及粪菌移植等。但这些技术或方法对于改善肠道菌群紊乱还有待提高，要么暂时有效、时间一长更严重(抗生素治疗)，要么效果有待提高或验证(益生菌)，要么接受程度差(中药汤剂、粪菌移植)等。虽然已经证实某些中药(方剂)在治疗肠道菌群紊乱方面具有很好作用。但其中一些中药具有肝肾毒性，且需要深厚中医药功底和深奥的组方，因此，中药治疗肠道菌群紊乱对于普通人员来说尚不能普及，需要在中医师的指导下进行。因此，亟需一种安全且能治疗抗生素所致肠道菌群紊乱的药物。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种松果菊苷在制备治疗抗生素相关性腹泻药物中的应用，药食同源的松果菊苷可以通过调节肠道菌群紊乱，对肠道内的有益菌、致病菌和病毒进行良性调整，改善抗生素所致的腹泻症状。

为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种松果菊苷在制备治疗抗生素相关性腹泻药物中的应用。

优选的，所述松果菊苷通过调节抗生素所致肠道菌群紊乱实现抗生素相关性腹泻的治疗。

更优选的，所述调节抗生素所致肠道菌群紊乱包括：增加肠道中有益细菌的数量、抑制肠道中有害细菌的数量、抑制肠道中病毒的数量以及抑制肠道中真菌的数量。

更优选的，所述有益细菌包括拟杆菌属(Bacteroides)、乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、梭菌属(Clostridium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、副杆菌属(Parabacteroides)、埃希氏菌属(Escherichia)、巴斯德氏菌科菌属(Pasteurellaceaebacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)、地杆菌属(Pedobacter)、放线杆菌属(Actinobacillus)、假丁酸弧菌属(Pseudobutyrivibrio)、链球菌属(Streptococcus)、曼氏杆菌属(Mannheimia)、密螺旋体属(Treponema)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、梭杆菌属(Fusobacterium)、纤维杆菌属(Fibrobacter)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、消化球菌属(Peptococcus)、真杆菌属(Eubacterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillius subtilis)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、产丁酸球菌属(Butyricococcus)、普氏栖粪杆菌(Faecalibacteriumprausnitzii)、酪酸梭菌(Clostridiumbutyricum)中的任意一种或多种。

更优选的，所述有害细菌包括肠球菌属(Enterococcus)、节细菌属(Arthrobacter)、厌氧弧菌属(Anaerovibrio)、薄层菌属(Hymenobacter)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)、巨球菌属(Megasphaera)、普氏菌属(Prevotella)、脱磷弧菌属(Desulfovibrio)、嗜胆菌属(Bilophila)、水栖菌属(Enhydrobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、粪球菌属(Coprococcus)、罗氏菌属(Roseburia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、志贺杆菌属(Shigella)、柠檬酸杆菌(Citrobacter)、沙门氏菌(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、李斯特菌属(Listeria)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)中的任意一种或多种。

更优选的，所述病毒包括人乳腺病毒(Humanmastadenovirus)、人肠道病毒(HumanEnterovirus)、轮状病毒(Rotavirus)、肠道腺病毒(Enteroadenovirus)、杯状病毒(Calicivirus)、星状病毒(Astrovirus)、细小病毒(Parvovirus)、微小RNA病毒(MicroRNAvirus)、噬菌体(Phage)中的任意一种或多种。

更优选的，所述真菌包括假丝酵母属(Candida)、曲霉属(Aspergillus)、隐球酵母属(Cryptococcus)、毛霉属(Mucor)、红酵母属(Rhodotorula)、青霉属(Penicillium)、德巴利酵母属(Debaryomyces)和毛孢子菌属(Trichosporon)中的任意一种或多种。

本发明还提供了一种治疗抗生素相关性腹泻的药物组合物，所述药物组合物以松果菊苷为单一或共同活性成分。

优选的，所述共同活性成分为中药单药、中药提取物或中药有效成分。

优选的，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种松果菊苷在制备治疗抗生素相关性腹泻药物中的应用，所述松果菊苷提取自肉苁蓉，为药食同源物质，对人体没有任何不良反应。经试验证实可知，利用松果菊苷治疗发生抗生素相关性腹泻的小鼠后，小鼠的体重恢复，肠道炎症消失，腹泻症状明显改善；同时小鼠肠道菌群丰度和多样性恢复至正常水平，肠道菌群结构得到良性调整，表明所述松果菊苷可以通过调整肠道菌群紊乱治疗抗生素相关性腹泻，具有良好的应用和商业开发价值。

附图说明

图1为小鼠一般体征及腹泻评分；其中，A为小鼠的体重变化曲线；B为小鼠粪便评分变化曲线。

图2为小鼠结肠HE染色结果。

图3为松果菊苷对AAD小鼠肠道菌群α多样性影响结果；其中，A为韦恩图；B为稀释曲线。

图4为小鼠肠道菌群β多样性结果；其中，A为PCoA分析；B为LEfSe分析。

图5为小鼠肠道菌群丰度；其中，A为门水平TOP10相对丰度；B为属水平TOP30相对丰度。

图6为小鼠属水平Metastat。

具体实施方式

本发明提供了一种松果菊苷在制备治疗抗生素相关性腹泻药物中的应用。

本发明中，所述松果菊苷由肉苁蓉中提取得到；所述提取方法优选的选自煎煮法、溶剂浸提法、渗漉法、回流法、超声提取法、超临界萃取法、水蒸气蒸馏法、树脂吸附分离法、纳米材料分离法或凝胶色谱分离法中任意一种。本发明中，所述松果菊苷优选包括肉苁蓉水提物、醇提物、酯提物或醚提物中的任意一种。

本发明中，所述松果菊苷通过调节抗生素所致肠道菌群紊乱实现抗生素相关性腹泻的治疗；所述调节抗生素所致肠道菌群紊乱优选的包括：增加肠道中有益细菌的数量、抑制肠道中有害细菌的数量、抑制肠道中病毒的数量以及抑制肠道中真菌的数量。本发明中，所述有益细菌优选的包括拟杆菌属(Bacteroides)、乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、梭菌属(Clostridium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、副杆菌属(Parabacteroides)、埃希氏菌属(Escherichia)、巴斯德氏菌科菌属(Pasteurellaceaebacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)、地杆菌属(Pedobacter)、放线杆菌属(Actinobacillus)、假丁酸弧菌属(Pseudobutyrivibrio)、链球菌属(Streptococcus)、曼氏杆菌属(Mannheimia)、密螺旋体属(Treponema)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、梭杆菌属(Fusobacterium)、纤维杆菌属(Fibrobacter)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、消化球菌属(Peptococcus)、真杆菌属(Eubacterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillius subtilis)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、产丁酸球菌属(Butyricococcus)、普氏栖粪杆菌(Faecalibacteriumprausnitzii)、酪酸梭菌(Clostridiumbutyricum)中的任意一种或多种；所述有害细菌优选的包括肠球菌属(Enterococcus)、节细菌属(Arthrobacter)、厌氧弧菌属(Anaerovibrio)、薄层菌属(Hymenobacter)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)、巨球菌属(Megasphaera)、普氏菌属(Prevotella)、脱磷弧菌属(Desulfovibrio)、嗜胆菌属(Bilophila)、水栖菌属(Enhydrobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、粪球菌属(Coprococcus)、罗氏菌属(Roseburia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、志贺杆菌属(Shigella)、柠檬酸杆菌(Citrobacter)、沙门氏菌(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、李斯特菌属(Listeria)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)中的任意一种或多种；所述病毒优选的包括人乳腺病毒(Humanmastadenovirus)、人肠道病毒(HumanEnterovirus)、轮状病毒(Rotavirus)、肠道腺病毒(Enteroadenovirus)、杯状病毒(Calicivirus)、星状病毒(Astrovirus)、细小病毒(Parvovirus)、微小RNA病毒(MicroRNAvirus)、噬菌体(Phage)中的任意一种或多种；所述真菌优选的包括假丝酵母属(Candida)、曲霉属(Aspergillus)、隐球酵母属(Cryptococcus)、毛霉属(Mucor)、红酵母属(Rhodotorula)、青霉属(Penicillium)、德巴利酵母属(Debaryomyces)和毛孢子菌属(Trichosporon)中的任意一种或多种。本发明中，所述人肠道病毒(HumanEnterovirus)优选的包括脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)、埃可病毒(Echovirus)及新型肠道病毒。

本发明还提供了一种治疗抗生素相关性腹泻的药物组合物，所述药物组合物以松果菊苷为单一或共同活性成分。本发明中，所述松果菊苷作为共同活性成分时，优选的与其它中药单药、中药提取物或中药有效成分组成药物组合物应用。所述松果菊苷与其它中药单药、中药提取物或中药有效成分组成药物组合物应用时，优选的可作为君药、臣药、佐药或使药。本发明中，所述药物组合物优选的还包括药学上可接受的载体。本发明对所述药学上可接受的载体种类并没有特殊要求，根据药物剂型需求进行常规选择即可。

本发明的具体实施例中，所有数据均采用SPSS25.0软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差(x±s)表示，正态分布资料采用单因素方差分析(ANOVA)，非正态分布资料采用非参数检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

1.实验动物与分组

本发明实施例所采用的小鼠均为6周龄(20g左右)的雄性Balb/c品系SPF级小鼠(购自北京维通利华公司)。动物饲养于清洁级实验动物房中，使用标准鼠饲料和水，12h昼夜交替，室内温度20～24℃，相对湿度50～60％。本发明所有动物均严格按照动物伦理程序和规范处理。

小鼠适应性饲养1周后，按照数字表法随机分为4组，分别为对照(CON)组、AAD组(即抗生素腹泻组)、菊粉(INU)组、松果菊苷(ECH)组，每组8只小鼠。AAD组造模小鼠每天灌胃盐酸林可霉素(购自北京索莱宝科技有限公司)3g/kg，连续给药7d；CON组小鼠灌胃同体积的生理盐水。7d后得到AAD模型。

2.各组给药方案：

菊粉(INU)组：根据小鼠体重按5g/kg的剂量灌胃菊粉(购自上海生工)0.2mL，1次/d，连续治疗7d；松果菊苷(ECH)组：根据小鼠体重按90mg/kg的剂量灌胃松果菊苷(购自成都瑞芬思生物公司)0.2mL，1次/d，连续治疗7d；其中，菊粉(INU)组为阳性对照。CON组和AAD组小鼠灌胃同体积的生理盐水。

3.一般情况观察

在上述给药治疗实验期间，每天固定时间清洁鼠笼，观察并记录小鼠的体重变化、精神状态和粪便特征，从体重变化、精神状态和粪便稠度等方面计算各组腹泻的严重程度，结果如图1。

实施例2

结肠组织观察

实施例1所述各组小鼠给药7d后，取各组小鼠病变结肠组织置于4％的多聚甲醛(购自武汉塞维尔生物科技有限公司)中固定，进行石蜡包埋，切片，并用苏木素-伊红(HE)染色，在正置白光拍照显微镜(日本尼康公司)下观察切片，得到结果如图2。

实施例3

菌群分析

1)样本收集

实施例1所述各组小鼠给药7d后，处死所有小鼠，取结肠内容物保存于液氮中，然后转移至-80℃冰箱(Thermo，USA)保存。

2)Illumina Miseq测序

将冻存的小鼠结肠内容物利用天根磁珠法提取试剂盒(Qiagen,Valencia,California,USA)提取基因组DNA，以该基因组DNA为模板进行PCR扩增，将扩增的PCR产物利用DNA纯化回收试剂盒(TianGen,China)纯化后，使用Illumina公司TruSeq DNA PCR-FreeLibrary Preparation Kit建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit定量和文库检测，合格后，使用NovaSeq6000进行上机测序，将所得数据应用GraphPadPrism8软件作图分析，得到图3-图6。

根据结果可以看出，灌胃盐酸林可霉素7天后，小鼠开始出现不同程度的腹泻，表现为精神萎靡，摄食量减少和排便次数增加等症状，严重者可见肛门处有粪便黏附。造模结束后，小鼠体重减轻，出现明显腹泻症状，结肠组织明显炎性改变，小鼠肠道拟杆菌属(Bacteroides)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)等益生菌含量减少，Proteus菌属、大肠埃希氏菌-志贺氏菌(Escherichia–Shigella)、肠球菌(Enterococcus)等机会致病菌含量增加，表明AAD模型构建成功。

给予松果菊苷治疗后，小鼠体重恢复，腹泻症状明显改善；小鼠肠道炎症消失，结肠病理恢复至正常水平；小鼠肠道菌群α多样性和β多样性分析结果显示，松果菊苷组小鼠肠道菌群丰度和多样性恢复至正常水平，肠道菌群结构得到良性调整，肠道乳酸杆菌(Lactobacillus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、Prevotella菌属、Dubosiella菌属、Alistipes菌属、Erysipelatoclostridium菌属和Pseudomonas菌属等含量增加，即松果菊苷可以通过调整肠道菌群紊乱治疗AAD。上述结果表明，松果菊苷可以通过调节肠道微生物群，对肠道内的有益菌和致病菌进行良性调整，从而调节肠道菌群代谢产物，改善抗生素相关性小鼠腹泻症状。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。