瑞马唑仑在制备治疗、减缓或处理骨癌疼痛的产品中的用途

摘要

本发明属于医药技术领域，公开了瑞马唑仑或其药学上可接受的盐在制备治疗、减缓或处理骨癌疼痛的产品中的用途。本申请发现瑞马唑仑或其药学上可接受的盐具有明显骨癌疼痛缓解效果。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及瑞马唑仑在制备治疗、减缓或处理骨癌疼痛的产品中的用途。

背景技术

晚期癌症如肺癌、乳腺癌、甲状腺癌和膀胱癌患者常发生癌症骨转移并伴有溶骨性病变和剧烈疼痛。研究表明，约75％的晚期癌症患者经历中重度的骨癌疼痛，超过半数的转移性癌症疼痛患者报告表示目前可用的药物治疗不足以缓解疼痛且具有明显的副作用。骨癌痛是一种难治性的疼痛，按照WHO三阶梯治疗方法仍然有一半以上的患者效果不佳，而且长时间应用阿片类强效镇痛药容易产生耐药，成瘾，便秘等副作用。另外，骨癌痛患者的疼痛控制不足往往伴有抑郁、焦虑、功能受损和生活质量的显著降低，导致发病率和死亡率的增加。目前研究认为骨癌痛的机制主要跟肿瘤压迫骨组织的支配神经或者肿瘤释放致痛的炎性物质引起的局部神经感受器痛觉过敏，即痛觉的“外周敏化”，长期持续刺激还会引起脊髓或脑组织相应结构区域发生病理生理改变，对痛觉信号传递产生易化和放大作用，即“中枢敏化”，总之骨癌痛机制非常复杂，目前缺乏特效镇痛药物，因此，目前在深入研究骨癌痛的发生机制过程中也在不断寻找和测试新的药物和靶点，为临床上寻找骨癌痛新的治疗方法和药物研发提供思路。

瑞马唑仑(CNS 7056)是一种新型苯二氮卓类药物，具有起效快，维持和恢复时间短，无积蓄，代谢不依赖肝肾功能、无严重副作用等特点，是一种良好的镇静催眠药物。瑞马唑仑作用于GABAA受体，增强含有γ亚基的GABAA受体活性，从而抑制神经元电活动，产生镇静作用。瑞马唑仑在体内快速被非特异性酯酶水解为唑仑丙酸，唑仑丙酸对GABAA受体的亲和力仅为瑞马唑仑的1/400，几乎不具有药理活性，因此患者恢复时间短于咪达唑仑。瑞马唑仑目前已经在国内作为1.1类新药上市，是一种用于临床麻醉的麻醉性镇静药，具有镇静催眠作用。适应证包括门诊无痛胃肠镜，气管镜的镇静，全身麻醉的镇静等，主要用于全身麻醉镇静，其目前的出厂药物说明书中未提及其镇痛和其他药理作用。

在最新有关瑞马唑仑其他药理效应的相关研究中，曾有报道提示瑞马唑仑具有抑制肿瘤生长的作用，如瑞马唑仑能抑制神经胶质瘤细胞生长，并通过下调NF-κB途径诱导细胞凋亡。瑞马唑仑还具有显著的抗炎作用，如瑞马唑仑能通过激活外周苯二氮卓类受体来抑制炎症反应，从而抑制脓毒症相关的急性肝损伤。

以上查阅所有现有技术中的相关专利及文献中，均未提及有关瑞马唑仑可作为镇痛药治疗骨癌痛的相关研究报道。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供瑞马唑仑在制备治疗、减缓或处理骨癌痛的产品中的用途，以期解决现有技术中存在的问题。

为实现上述目的，本发明具体采用如下技术方案。

本发明的第一方面保护瑞马唑仑或其药学上可接受的盐在制备治疗、减缓或处理骨癌疼痛的产品中的用途。

在某些实施方式中，所述骨癌痛为起源于骨的癌症或者来自转移到骨的癌症。

在某些具体的实施方式中，所述起源于骨的癌症选自骨肉瘤癌症。

在某些具体的实施方式中，所述来自转移到骨的癌症选自乳癌、前列腺癌、肺癌、肾脏癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、甲状腺癌、子宫颈癌、结肠癌、食道癌或鼻咽癌中的一种或多种。

在某些实施方式中，所述瑞马唑仑或其药学上可接受的盐的有效剂量为每日10～40mg/Kg体重/次。

在某些实施方式中，药学上可接受的盐选自苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、羟乙磺酸盐和萘磺酸盐中的一种或多种。

在某些实施方式中，所述瑞马唑仑或其药学上可接受的盐单独使用或与其他药物联合使用。

在某些具体的实施方式中，所述瑞马唑仑或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的辅料组成药物组合物。

在某些更具体的实施方式中，所述药物组合物为溶液剂、注射剂、喷雾剂、滴鼻剂、气雾剂、粉雾剂、片剂、胶囊剂和颗粒剂中的一种或多种。

本发明的第二方面保护一种用于治疗、减缓或处理骨癌痛的产品，所述产品包含瑞马唑仑或其药学上可接受的盐，以及药物上可接受的载体。

在某些实施方式中，所述产品选自药物、保健品和食品。

本发明的第三方面保护一种治疗、减缓或处理骨癌疼痛的方法，包括如下步骤：为向对象施用瑞马唑仑或其药学上可接受的盐，或如上文所述的产品。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)本申请发现瑞马唑仑或其药学上可接受的盐能够高效且稳定的治疗、减缓或处理骨癌痛模型的疼痛，降低机械刺激爪退缩阈值和行走评分，且疼痛缓解作用随药物浓度增加而增强。

2)本申请发现瑞马唑仑或其药学上可接受的盐对骨癌痛具有急性镇痛效果，作用1h后即可产生强烈疼痛缓解效果，随后4h、8h仍有一定的疼痛缓解作用，在给药后24h疼痛缓解效果再次增强，直至72h失去镇痛效果。

3)本申请发现仅需要给药瑞马唑仑或其药学上可接受的盐1次，镇痛效果可以持续72h。

附图说明

图1显示为本发明实施例1中骨癌痛大鼠模型的爪机械退缩阈值图。

图2显示为本发明实施例1中骨癌痛大鼠模型的肢体使用评分图。

图3显示为本发明实施例1中不同浓度的瑞马唑仑对骨癌痛大鼠模型的爪机械退缩阈值的影响结果图。

图4显示为本发明实施例1中不同浓度的瑞马唑仑对骨癌痛大鼠模型的肢体使用评分的影响结果图。

图5显示为本发明实施例1中瑞马唑仑、氟马西尼以及瑞马唑仑和氟马西尼的组合对骨癌痛大鼠模型的爪机械退缩阈值的影响结果图。

图6显示为本发明实施例1中瑞马唑仑、氟马西尼以及瑞马唑仑和氟马西尼的组合对骨癌痛大鼠模型的肢体使用评分的影响结果图。

图7显示为本发明实施例1中瑞马唑仑与骨癌痛共同靶点韦恩图。

图8显示为本发明实施例1中瑞马唑仑与骨癌痛靶点的PPI网络图。

图9显示为本发明实施例1中采用MCC法筛选HUB基因。

图10显示为本发明实施例1中HUB基因的KEGG富集分析Top20结果图。

具体实施方式

本申请偶然发现瑞马唑仑运用于骨癌痛动物模型中，发现其具有镇痛作用，可显著缓解骨癌痛动物的疼痛，如缓解骨癌痛大鼠模型的患肢抬足、颤抖、咬爪、跛行等溶骨性病变和剧烈疼痛，而使用瑞马唑仑后再使用氟马西尼，则瑞马唑仑的镇痛效果明显解除，说明瑞马唑仑具有治疗、减缓或处理骨癌疼痛的作用。在此基础上，完成了本发明。

为了上述目的，本发明第一方面保护瑞马唑仑或其药学上可接受的盐在制备治疗、减缓或处理骨癌疼痛产品中的用途。

本发明中，可接受的盐是瑞马唑仑的盐，其是常规或药学上可接受的，并且具有母体化合物(parent compound)的理想活性的盐。所述盐包括(1)由盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸形成的；或由乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙烷-二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基双环[2，2，2]-辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔乙酸丁酯、十二烷基硫酸盐、葡萄糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等有机酸形成的酸加成盐(acid addition salt)；或(2)母体化合物中存在的酸性质子被取代而形成的盐。例如，药学上可接受的盐选自苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、羟乙磺酸盐和萘磺酸盐中的一种或多种。

本发明中，所述骨癌痛为起源于骨的癌症或者来自转移到骨的癌症。优选地，所述起源于骨的癌症选自骨肉瘤癌症。所述来自转移到骨的癌症选自乳癌、前列腺癌、肺癌、肾脏癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、甲状腺癌、子宫颈癌、结肠癌、食道癌或鼻咽癌中的一种或多种。

本发明中，所述瑞马唑仑或其药学上可接受的盐的有效剂量为单次10～40mg/Kg体重/次。优选地，有效剂量可以为10～30mg/Kg体重/次，可以为15～35mg/Kg体重/次，也可以为20～40mg/Kg体重/次，如10mg/Kg体重/次、20mg/Kg体重/次、25mg/Kg体重/次、30mg/Kg体重/次、40mg/Kg体重/次。

本发明中，所述瑞马唑仑或其药学上可接受的盐单独使用或与其他药物联合使用。优选地，所述瑞马唑仑或其药学上可接受的盐和药学上可接受的辅料组成药物组合物。更有选地，所述药学上可接受的辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。例如，所述药学上可接受的辅料包括载体、介质，例如无菌水或生理盐水、稳定剂、赋形剂、抗氧化剂(抗坏血酸等)、缓冲剂(磷酸、枸橼酸、其它的有机酸等)、防腐剂、表面活性剂(PEG、Tween等)、螯合剂(EDTA等)、粘合剂等。而且，也可含有其它低分子量的多肽；血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白质；甘氨酸、谷酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸等氨基酸；多糖和单糖等糖类或碳水化物；甘露糖醇或山梨糖醇等糖醇。当制备用于注射的水溶液时，例如生理盐水、含有葡萄糖或其它的辅助药物的等渗溶液，如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠，可并用适当的增溶剂例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇，PEG等)、非离子表面活性剂(吐温80，HCO-50)等。所述药物组合物制成注射剂、注射用无菌粉末、片剂、丸剂、胶囊、锭剂、醑剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、或栓剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。优选地，为溶液剂。本发明，所述药物组合物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。优选地，通过腹腔注射。

本发明中，所述药物组合物还可与其他治疗手段结合使用，所述其他手段包括手术、放疗、化疗、靶向治疗。

本发明中，所述药物组合物主要针对的对象为哺乳动物。

本发明的另一方面保护用于治疗、减缓或处理骨癌痛的产品，所述产品包含瑞马唑仑或其药学上可接受的盐，以及药物上可接受的载体。

本发明中，所述产品选自药物、保健品或食品。

本发明中，所述药物、保健品或食品用于防止或降低痛觉的产生，如机械刺激爪退缩阈值和行走评分。

本发明中，所述药物、保健品或食品用于减轻痛觉的程度，或者治愈后痛觉使之正常化，或者减缓骨癌痛痛觉的进程。本发明的另一方面治疗、减缓或处理骨癌疼痛骨癌痛的方法，包括如下步骤：为向对象施用瑞马唑仑或其药学上可接受的盐，或如上文所述的产品。

本发明中，有效量是足以达到包括减轻或减少疼痛的有益或期望的临床结果的量。为了本发明的目的，瑞马唑仑或其药学上可接受的盐的有效量是足以治疗、改善、减少疼痛的强度或者预防包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛的量。在一些实施方案中，有效量可减少进行性的疼痛和/或突破性的疼痛(包括步行痛和接触引发的疼痛)的疼痛，其可在癌症转移到骨之前、期间和/或之后施用。在一些实施方案中，有效量是足以延缓包括与骨转移有关癌症疼痛的骨癌痛的发展的量。优选地，所述瑞马唑仑或其药学上可接受的盐施于对象的有效剂量为10～40mg/Kg体重/次，单次腹腔注射。具体地，有效剂量为每日25mg/Kg体重，单次腹腔注射。

本发明中，所述对象是哺乳动物。所更优选地，所述哺乳动物是灵长类动物、犬科动物(如狗)、猫科动物(如猫)、牛科动物(如奶牛)、科动物(如绵羊、山羊)、猪科动物、骆驼科动物、啮齿动物(如豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)和马科动物(如马)中的一种或多种。进一步优选地，为猴、猿或人。

本发明中，所述施用的方式为腹腔注射。

本申请中预防，是指在使用瑞马唑仑或其药学上可接受的盐或如上文所述的产品后防止或降低或缓解痛觉的产生，如因疼痛产生的颤抖、咬爪、跛行。

本申请中治疗，是指减轻痛觉的程度，或者治愈后痛觉使之正常化，或者减缓骨癌痛痛觉的进程。

本申请发现瑞马唑仑或其药学上可接受的盐能够高效且稳定的缓解骨癌痛模型的疼痛，降低机械刺激爪退缩阈值和行走评分，且疼痛缓解作用随药物浓度增加而增强，此外，其具有急性镇痛效果，作用1h后即可产生强烈疼痛缓解效果，随后4h、8h仍有一定的疼痛缓解作用，在给药后24h疼痛缓解效果再次增强，直至72h失去镇痛效果，且仅需要给药1次，镇痛效果可以持续72h。阿片类镇痛药长期使用对人体具有一定毒副作用，如成瘾、便秘、呼吸抑制等，且会产生耐受性，而本申请的瑞马唑仑或其药学上可接受的盐无以上副作用，也不会产生耐受性。

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1

1.1、实验动物与材料

1.1.1实验动物

从上海杰思捷实验动物有限公司购买180g-200g的SD雌性大鼠。

饲养条件：清洁级饲养环境，给予充足的食物和饮用水，室内恒温22～24℃。

1.1.2药物与试剂

药物：瑞马唑仑(根据参考文献1中大鼠剂量25mg/kg为中位值，设置5个剂量梯度：10mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg，瑞马唑仑购买于江苏恒瑞医药股份有限公司，采用生理盐水为溶剂进行稀释)、氟马西尼(本品为瑞马唑仑的选择性拮抗剂，1mg/kg，购买于浙江奥托康制药集团股份有限公司，采用生理盐水为溶剂进行稀释)

注射方式：腹腔给药。

1.1.3实验仪器

Von Frey纤维丝，美国Stoelting公司

1.2、实验方法

1.2.1动物分组和给药

将实验动物随机分为7组进行药物剂量梯度实验，每6只大鼠一组，7组包括：假手术组(Sham+vehicle)、骨癌痛模型组(BCP+vehicle)、骨癌痛瑞马唑仑组(BCP+Rem 10mg/kg，BCP+Rem 20mg/kg，BCP+Rem 25mg/kg，BCP+Rem 30mg/kg和BCP+Rem 40mg/kg)。

假手术组(Sham+vehicle)为待大鼠适应环境一周后，在大鼠右侧胫骨腔内注射5μL生理盐水。

其余组别，待大鼠适应环境一周后，在大鼠右侧胫骨腔内注射5μL Walker256肿瘤细胞(5×10

骨癌痛模型组(BCP+vehicle)：骨癌痛大鼠模型腹腔注射2mL生理盐水。

骨癌痛瑞马唑仑组(BCP+Rem)：骨癌痛大鼠模型分别通过腹腔注射2mL的10mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg的瑞马唑仑注射液。

分别在注射后1h、2h、4h、8h、24h、48h和72h进行疼痛行为学检测，疼痛行为学检测指标包括机械刺激爪退缩阈值(Paw withdrawal mechanical threshold assay，PWMT)和行走评分(Limb use score，LUS)，随后采用网络药理学分析法，分析瑞马唑仑镇痛的机制。

1.2.2机械刺激爪退缩阈值(PWMT)

将各组大鼠单独放置在避光且安静的单独隔间中适应约30分钟，随后从1g VonFrey纤维丝开始，垂直刺激大鼠右后足底约5s，观察大鼠是否有患肢抬足，颤抖，咬爪等现象，若5次刺激中有3次及以上反应，记下当前克数。

按照刺激力度递增的顺序依次施加，直至出现抬足等疼痛反应。15g为最大测量范围，若15g仍不能引起大鼠的疼痛反应，记为15g。

1.2.3行走评分(LUS)

将各组大鼠放置在开阔空间中，观察其自由行走时肢体的使用情况。根据后肢的使用情况进行评分：正常行走为4分；轻度跛行为3分；严重跛行为2分；严重跛行并伴随部分失用为1分；完全失用为0分。

1.2.4网络药理学分析

为分析瑞马唑仑作用于骨癌痛的可能机制，对瑞马唑仑进行网络药理学分析。

使用GeneCards、OMIM和TTD等数据库获取骨癌痛靶点，Swisstargetprediction、PharmMapper、SEA等数据库获取瑞马唑仑作用蛋白靶点，并使用韦恩图获取骨癌痛与瑞马唑仑靶点，结果见图7。

将重合靶点导入STRING、Metascape、cytoscape获得蛋白互作图与关键蛋白靶点并进行KEGG富集分析，结果见图8、图9和图10。

网络药理学分析采用的方法详见参考文献2、3、4：

文献1.Kilpatrick GJ,McIntyre MS,Cox RF,Stafford JA,Pacofsky GJ,LovellGG,Wiard RP,Feldman PL,Collins H,Waszczak BL,Tilbrook GS:CNS 7056:a novelultra-short-acting Benzodiazepine.Anesthesiology Jul；107(1):60-6.doi:10.1097/01.anes.0000267503.85085.c0.

文献2.Bai LL,Chen H,Zhou P,Yu J.Identification of Tumor NecrosisFactor-Alpha(TNF-α)Inhibitor in Rheumatoid Arthritis Using NetworkPharmacology and Molecular Docking.Front Pharmacol.2021May 21；12:690118.doi:10.3389/fphar.2021.690118.

文献3.Guo B,Zhao C,Zhang C,Xiao Y,Yan G,Liu L,Pan H.Elucidation ofthe anti-inflammatory mechanism of Er Miao San by integrative approach ofnetwork pharmacology and experimental verification.Pharmacol Res.2022Jan；175:106000.doi:10.1016/j.phrs.2021.106000.Epub 2021Nov 24.

文献4.Aihaiti Y,Song Cai Y,Tuerhong X,Ni Yang Y,Ma Y,Shi Zheng H,XuK,Xu P.Therapeutic Effects of Naringin in Rheumatoid Arthritis:NetworkPharmacology and Experimental Validation.Front Pharmacol.2021May 14；12:672054.doi:10.3389/fphar.2021.672054.

1.2.5统计方法

实验数据用mean±SD表示，使用GraphPad Prism 8.0进行数据分析与作图，P<0.05认为差异有统计学意义，

1.3、实验结果

1.3.1成功建立骨癌痛大鼠模型

图1和图2分别为本实施例中骨癌痛大鼠模型的爪机械退缩阈值图(PWMT)和肢体使用评分(LUS)图。

实验结果证明，建立骨癌痛大鼠模型后的第7天开始出现明显的疼痛行为学改变，直到14天痛阈值达到最低值(2g)且疼痛行为学改变最为显著。与假手术组(Sham+vehicle)组相比，骨癌痛模型组(BCP+vehicle)组大鼠的PWMT和LUS具有明显下降，下降程度随时间增加的特点，表明骨癌痛大鼠模型构建成功，且随时间增加，骨癌生长出现越来越剧烈的骨癌疼痛表现。

1.3.2腹腔注射不同浓度的瑞马唑仑对骨癌痛大鼠爪机械退缩阈值(PWMT)和肢体使用评分(LUS)的影响

图3和图4分别表示腹腔注射不同药物浓度的瑞马唑仑对骨癌痛大鼠的爪机械退缩阈值图(PWMT)和肢体使用评分(LUS)的影响。

实验结果证明，瑞马唑仑对骨癌痛大鼠的爪机械退缩阈值(PWMT)和肢体使用评分(LUS)具有明显的缓解作用，且疼痛缓解作用随药物浓度增加而增强。

1.3.3瑞马唑仑与骨癌痛靶点网络药理学分析结果

图7是瑞马唑仑与骨癌痛共同靶点韦恩图。

实验结果证明，从SwissTargetPrediction、Pharm Mapper和Similarityensemble approach(SEA)等数据库网站搜索到瑞马唑仑的作用靶点363个，以及从Genecards、OMIM和TTD等数据库中搜索到骨癌痛的作用靶点1404个。将两者的作用靶点通过维恩图进行交互，得到共同靶点109个。

图8是瑞马唑仑与骨癌痛靶点的PPI网络图。

将得到的109个共同靶点导入STRING网站并进行蛋白质互作分析，得到的结果再次导入Cytoscape 3.9.1软件，最后得到图8的结果。游离蛋白不相互作用，其他相互作用的蛋白通过连线进行连接。该蛋白相互作用的次数越多，圆圈越大，且颜色越深。

图9是采用MCC法筛选HUB基因。

在Cytoscape 3.9.1软件中对筛选的109个靶点进行MCC算法检测并选择前十的靶点，分别是Stat1、Egfr、Alb、Bcl2l1、Mtor、Casp3、Igf1、Ptgs2、Src、Hsp90aa1。

图10是共同靶点的KEGG富集分析Top20结果图。

对共同靶点进行KEGG富集分析并获取与瑞马唑仑和骨癌痛共同靶点最相关的前20信号通路。结果表明瑞马唑仑与PI3K/Akt等信号通路关联度较高，因此认为瑞马唑仑可能通过抑制PI3K/Akt通路而发挥镇痛效果。

1.4、为了验证瑞马唑仑组的镇痛效果

通过前述剂量梯度实验计算瑞马唑仑的ED50约为25mg/kg。按文献1报道，25mg/kg的瑞马唑仑使大鼠翻正反射消失持续时间为9.6±0.19min，本实验测试25mg/kg的瑞马唑仑镇痛效应，用药1h开始疼痛行为学测试，此时药物的镇静作用完全消失，观察到的行为学改变为药物的真实镇痛效应。

将大鼠随机分为4组，每6只大鼠一组，4组包括：假手术组(Sham+vehicle)、骨癌痛模型组(BCP+vehicle)、骨癌痛瑞马唑仑组(BCP+Rem 25mg/kg)和骨癌痛瑞马唑仑氟马西尼组(BCP+Rem+Fum)。

假手术组(Sham+vehicle)为待大鼠适应环境一周后，在大鼠右侧胫骨腔内注射5μL生理盐水。

其余组别，待大鼠适应环境一周后，在大鼠右侧胫骨腔内注射5μL Walker256肿瘤细胞(5×10

骨癌痛瑞马唑仑组(BCP+Rem 25mg/kg)：骨癌痛大鼠模型通过腹腔注射2mL的25mg/kg的瑞马唑仑注射液。

骨癌痛氟马西尼组(BCP+Fum 1mg/kg)：骨癌痛大鼠模型通过腹腔注射0.5mL的1mg/kg的瑞马唑仑注射液。

骨癌痛瑞马唑仑氟马西尼组(BCP+Rem+Fum)：骨癌痛大鼠模型通过腹腔注射2mL的25mg/kg瑞马唑仑注射液和0.5mL的1mg/kg氟马西尼注射液。

分别在注射后1h、2h、4h、8h、24h、48h和72h进行疼痛行为学检测，疼痛行为学检测指标包括机械刺激爪退缩阈值(Paw withdrawal mechanical threshold assay，PWMT)、行走评分(Limb use score，LUS)。

图5和图6分别为本实施例中腹腔注射分别瑞马唑仑、氟马西尼以及瑞马唑仑和氟马西尼的组合后各组大鼠的爪机械退缩阈值图(PWMT)和肢体使用评分(LUS)的结果图。

从图5和图6可知，骨癌疼痛模型(BCP+vehicle)组构建后，疼痛明显；与BCP+vehicle组(BCP组)相比，腹腔注射25mg/kg瑞马唑仑组(BCP+Rem)组出现了明显的疼痛的缓解现象，具体表现为BCP+Rem组在给药后1h有明显的疼痛缓解并达到峰值，随后4h、8h仍有一定的疼痛缓解作用，但疼痛缓解作用逐渐减低。在给药后24h疼痛缓解效果再次增强，直至72h失去镇痛效果。而BCP+Rem+Fum组中，添加抑制剂氟马西尼能有效解除瑞马唑仑的镇痛效果。骨癌痛氟马西尼组(BCP+Fum 1mg/kg)说明氟马西尼单独使用对动物没有明显副作用。以上结果表明，瑞马唑仑具有明显骨癌疼痛缓解作用。

本申请发现瑞马唑仑或其药学上可接受的盐能够高效且稳定的缓解骨癌痛模型的疼痛，降低机械刺激爪退缩阈值和行走评分，且疼痛缓解作用随药物浓度增加而增强，此外，其具有急性镇痛效果，作用1h后即可产生强烈疼痛缓解效果，随后4h、8h仍有一定的疼痛缓解作用，在给药后24h疼痛缓解效果再次增强，直至72h失去镇痛效果，且仅需要给药1次，镇痛效果可以持续72h。此外，本申请的瑞马唑仑或其药学上可接受的盐无明显毒副作用，也不会产生耐受性。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。