一种制备改善慢性肾脏病大鼠肾功能的粪菌液的方法

摘要

本发明公开了粪菌液领域内的一种制备改善慢性肾脏病大鼠肾功能的粪菌液的方法，包括以下步骤：（1）收集：SPF级屏障收集大鼠粪便；（2）搅拌：将大鼠粪便置于搅拌器，加入PBS溶液，搅拌均匀；（3）离心：将获得的粪便溶液离心3分钟，并收集上清液。本发明能够通过制备的粪菌液来重塑肠道菌群以改善CKD大鼠肾功能和肠道微生态。

说明书

技术领域

本发明属于粪菌液领域，特别涉及一种制备改善慢性肾脏病大鼠肾功能的粪菌液的方法。

背景技术

目前，慢性肾脏病（CKD）被定义为各种原因引起的肾脏结构或功能异常（肾脏损害病史＞3个月)。最新流行病学调查研究显示，CKD波及到全球9.7%以上的人口，已严重威胁人类健康。然而，导致肾脏结构或功能异常的风险因素多种，并且发病机制尚未完全阐明。因此，目前可用于延缓CKD进展的策略较少且全面性欠缺，大多数治疗策略集中于减少蛋白尿，调节血压和降低尿酸等。显然，现有技术中急缺需要额外的治疗途径来延缓CKD进展。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备改善慢性肾脏病大鼠肾功能的粪菌液的方法，能够通过制备的粪菌液来重塑肠道菌群以改善CKD大鼠肾功能和肠道微生态。

本发明的目的是这样实现的：一种制备改善慢性肾脏病大鼠肾功能的粪菌液的方法，包括以下步骤：

（1）收集：SPF级屏障收集大鼠粪便；

（2）搅拌：将大鼠粪便置于搅拌器，加入PBS溶液，搅拌均匀；

（3）离心：将获得的粪便溶液离心3分钟，并收集上清液。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明制得的粪菌液可以改善慢性肾脏病大鼠肾功能指标（肌酐、尿素氮、尿蛋白）水平；重塑慢性肾脏病大鼠粪便短链脂肪酸产生菌（乳杆菌科、乳杆菌属、格氏乳杆菌）；提高慢性肾脏病大鼠粪便短链脂肪酸（乙酸、丁酸）浓度；降低慢性肾脏病大鼠肠道通透性；本发明的粪菌液来自益肾清利和络颗粒（YQHG）治疗8周的CKD大鼠，可为研究中医药改善动物的疾病指标和肠道微生态提供参考。

本发明的粪菌液通过重塑肠道菌群以改善CKD大鼠肾功能和肠道微生态。菌群转移实验实现肠道菌群重塑。其中，共饲养原理为利用啮齿动物食粪特性，以共饲养后的生活环境为媒介，实现菌群转移；粪菌移植的原理为利用微生物定植，实现菌群转移。本发明通过菌群转移实验，借助共饲养、粪菌移植的手段来重塑CKD大鼠肠道菌群。

本发明利用菌群转移实验，即共饲养结合粪菌移植，研究其对CKD大鼠肾功能和肠道微生态的影响。本发明的粪菌液来自益肾清利和络颗粒（YQHG）治疗8周的CKD大鼠，为研究中医药改善动物的疾病指标和肠道微生态提供参考。

作为本发明的进一步改进，所述步骤（1）中的SPF级屏障环境要求温度20-24℃、湿度40%-60%以及12小时光照和12小时黑暗的明暗交替循环。确保收集的大鼠粪便更加洁净安全，无特定病原微生物感染。

作为本发明的进一步改进，所述大鼠粪便为大鼠在自然状态下即刻排出体外的新鲜粪便。为了防止大鼠粪便受到污染。

作为本发明的进一步改进，所述大鼠粪便为益肾清利和络颗粒治疗8周的CKD大鼠排出的粪便。

作为本发明的进一步改进，所述步骤（2）中大鼠粪便与PBS溶液的质量体积比为90-110mg/1mL。PBS溶液起到缓冲作用。

为了保证收集的上清液纯度更高，所述步骤（3）中的离心条件为2800-3200rpm，3-5℃。

附图说明

图1为五组实验大鼠的肌酐、尿素氮、尿蛋白水平。

图2是五组实验大鼠的粪便短链脂肪酸产生菌（乳杆菌科、乳杆菌属、格氏乳杆菌）。

图3是五组实验大鼠的粪便短链脂肪酸（乙酸、丁酸）浓度。

图4是五组实验大鼠的FITC-dextran浓度。

实施方式

实施例1

本实施例的制备改善慢性肾脏病大鼠肾功能的粪菌液的方法，包括以下步骤：

（1）收集：SPF级屏障收集大鼠粪便；SPF级屏障环境要求温度20℃、湿度50%以及12小时光照和12小时黑暗的明暗交替循环；所述大鼠粪便为大鼠在自然状态下即刻排出体外的新鲜粪便；所述大鼠粪便为益肾清利和络颗粒治疗8周的CKD大鼠排出的粪便；

（2）搅拌：将大鼠粪便置于搅拌器，加入PBS溶液，大鼠粪便与PBS溶液的质量体积比为100mg/1mL，搅拌均匀；

（3）离心：将获得的粪便溶液离心3分钟，并收集上清液；离心条件为2800rpm，4℃。

实施例2

本实施例的制备改善慢性肾脏病大鼠肾功能的粪菌液的方法，包括以下步骤：

（1）收集：SPF级屏障收集大鼠粪便；SPF级屏障环境要求温度22℃、湿度40%以及12小时光照和12小时黑暗的明暗交替循环；所述大鼠粪便为大鼠在自然状态下即刻排出体外的新鲜粪便；所述大鼠粪便为益肾清利和络颗粒治疗8周的CKD大鼠排出的粪便；

（2）搅拌：将大鼠粪便置于搅拌器，加入PBS溶液，大鼠粪便与PBS溶液的质量体积比为90mg/1mL，搅拌均匀；

（3）离心：将获得的粪便溶液离心3分钟，并收集上清液；离心条件为3000rpm，3℃。

实施例3

本实施例的制备改善慢性肾脏病大鼠肾功能的粪菌液的方法，包括以下步骤：

（1）收集：SPF级屏障收集大鼠粪便；SPF级屏障环境要求温度24℃、湿度60%以及12小时光照和12小时黑暗的明暗交替循环；所述大鼠粪便为大鼠在自然状态下即刻排出体外的新鲜粪便；所述大鼠粪便为益肾清利和络颗粒治疗8周的CKD大鼠排出的粪便；

（2）搅拌：将大鼠粪便置于搅拌器，加入PBS溶液，大鼠粪便与PBS溶液的质量体积比为110mg/1mL，搅拌均匀；

（3）离心：将获得的粪便溶液离心3分钟，并收集上清液；离心条件为3200rpm，5℃。

实施例4

本实施例的制备改善慢性肾脏病大鼠肾功能的粪菌液的方法，包括以下步骤：

（1）收集：SPF级屏障收集大鼠粪便；SPF级屏障环境要求温度23℃、湿度55%以及12小时光照和12小时黑暗的明暗交替循环；所述大鼠粪便为大鼠在自然状态下即刻排出体外的新鲜粪便；所述大鼠粪便为益肾清利和络颗粒治疗8周的CKD大鼠排出的粪便；

（2）搅拌：将大鼠粪便置于搅拌器，加入PBS溶液，大鼠粪便与PBS溶液的质量体积比为105mg/1mL，搅拌均匀；

（3）离心：将获得的粪便溶液离心3分钟，并收集上清液；离心条件为3100rpm，4℃。

实施例5

本实施例的制备改善慢性肾脏病大鼠肾功能的粪菌液的方法，包括以下步骤：

（1）收集：SPF级屏障收集大鼠粪便；SPF级屏障环境要求温度21℃、湿度45%以及12小时光照和12小时黑暗的明暗交替循环；所述大鼠粪便为大鼠在自然状态下即刻排出体外的新鲜粪便；所述大鼠粪便为益肾清利和络颗粒治疗8周的CKD大鼠排出的粪便；

（2）搅拌：将大鼠粪便置于搅拌器，加入PBS溶液，大鼠粪便与PBS溶液的质量体积比为95mg/1mL，搅拌均匀；

（3）离心：将获得的粪便溶液离心3分钟，并收集上清液；离心条件为2900rpm，5℃。

实施例6

本实施例的制备改善慢性肾脏病大鼠肾功能的粪菌液的方法，包括以下步骤：

（1）收集：SPF级屏障收集大鼠粪便；SPF级屏障环境要求温度24℃、湿度50%以及12小时光照和12小时黑暗的明暗交替循环；所述大鼠粪便为大鼠在自然状态下即刻排出体外的新鲜粪便；所述大鼠粪便为益肾清利和络颗粒治疗8周的CKD大鼠排出的粪便；

（2）搅拌：将大鼠粪便置于搅拌器，加入PBS溶液，大鼠粪便与PBS溶液的质量体积比为110mg/1mL，搅拌均匀；

（3）离心：将获得的粪便溶液离心3分钟，并收集上清液；离心条件为3100rpm，3℃。

采用上述各实施例制得的粪菌液对大鼠进行治疗。

通过菌群转移实验的方法对大鼠进行治疗：

第一步、准备实验对象

此部分实验对象总共包括五组，即假手术（Sham）组、模型（Model）组、菌群转移实验（CoHo-Model）组、YQHG共饲养组（CoHo-YQHG）组、YQHG组。其中，每组均包括6只CKD大鼠。具体来说，YQHG组和CoHo-YQHG组均为YQHG治疗8周的CKD大鼠，Model组和CoHo-Model组均为0.9%无菌生理盐水治疗8周的CKD大鼠；

分组后进行连续3周的菌群转移实验，目的是使CoHo-Model组大鼠肠道菌群重塑。

第二步、共饲养和粪菌移植

共饲养：共饲养原理为利用啮齿动物食粪特性，以共饲养后的生活环境为媒介，实现菌群转移。在SPF级、温度22℃、湿度50%和12/12小时明/暗循环的屏障下，进行共饲养分笼（2只/笼），每笼包括CoHo-Model组和CoHo-YQHG组大鼠各一只。共饲养的大鼠为6笼；共饲养时间为3周。

粪菌移植：利用微生物定植，实现菌群转移。粪菌移植的供体为YQHG治疗8周的CKD大鼠。受体为CoHo-Model组大鼠。在共饲养期间，每天给CoHo-Model组的大鼠予粪菌液灌胃；6只CoHo-Model组的大鼠分别采用实施例1-实施例6制得的粪菌液进行灌胃，实施例1-实施例6的粪菌液的制备时间要求在移植前10min内进行；每只大鼠灌胃体积为1mL/d，灌胃时间为3周。

共饲养和粪菌移植之后，测量五组实验对象的肌酐、尿素氮、尿蛋白；乳杆菌科、乳杆菌属、格氏乳杆菌；乙酸、丁酸；FITC-dextran；并绘制出附图。

本发明制得的粪菌液改善CKD大鼠肾功能指标（肌酐、尿素氮、尿蛋白）水平。

肌酐、尿素氮、尿蛋白是指示肾功能的关键标志物。如图1，所有数据均表示为均值±标准误。

本发明制得的粪菌液重塑CKD大鼠粪便短链脂肪酸产生菌（乳杆菌科、乳杆菌属、格氏乳杆菌）。

粪便短链脂肪酸产生菌（乳杆菌科、乳杆菌属、格氏乳杆菌）下降导致肠道微生态失调。如图2，所有数据均表示为均值±标准误。

本发明制得的粪菌液提高CKD大鼠粪便短链脂肪酸（乙酸、丁酸）浓度。

粪便短链脂肪酸有利于肠道屏障修复。如图3，所有数据均表示为均值±标准误。

本发明制得的粪菌液降低CKD大鼠肠道通透性。

肠道通透性增加导致菌群易位，加重肠道微生态失调。如图4，所有数据均表示为均值±标准误。

本发明利用菌群转移实验，即共饲养结合粪菌移植，研究其对CKD大鼠肾功能和肠道微生态的影响。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：（1）改善CKD大鼠肾功能指标（肌酐、尿素氮、尿蛋白）水平；（2）重塑CKD大鼠粪便短链脂肪酸产生菌（乳杆菌科、乳杆菌属、格氏乳杆菌）；（3）提高CKD粪便短链脂肪酸（乙酸、丁酸）浓度；（4）降低CKD大鼠肠道通透性；（5）本发明的粪菌液来自益肾清利和络颗粒（YQHG）治疗8周的CKD大鼠，可为研究中医药改善动物的疾病指标和肠道微生态提供参考。

本发明并不局限于上述实施例，在本发明公开的技术方案的基础上，本领域的技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中的一些技术特征作出一些替换和变形，这些替换和变形均在本发明的保护范围内。