生物标志物在制备用于糖尿病患者HFpEF检测试剂中的应用

摘要

本发明涉及试剂应用技术领域，尤其涉及生物标志物在制备用于糖尿病患者HFpEF(射血分数保留型心衰)检测试剂中的应用，其中所述生物标志物为ITGA1蛋白，还包括MYH11蛋白、IGF1R蛋白、HP蛋白和DES蛋白中的任意2种或2种以上蛋白的组合。本发明将所述生物标志物用于制备检测糖尿病患者HFpEF的试剂，可以提高检测的客观性、特异性和准确性。并且，ITGA1蛋白作为检测靶点或检测目标能有效评估已合并HFpEF的糖尿病人群的心脏结构和功能损伤程度，并预测其心脏结构和功能是否存在进一步恶化风险，起到及时预警的作用，有助于该类人群在心功能发生不可逆损伤或恶化之前及时发现并尽早进行临床干预，可有效延缓病情发展和减少经济支出。

说明书

技术领域

本发明涉及试剂应用技术领域，尤其涉及生物标志物在制备用于糖尿病患者HFpEF检测试剂中的应用。

背景技术

心力衰竭是心血管疾病的终末阶段，其致残率和致死率居高不下，严重威胁人类健康，是21世纪心血管疾病面临的重要健康问题。2021年欧洲心力衰竭协会、美国心力衰竭学会和日本心力衰竭学会共同发布了《心力衰竭的通用定义和分类》，将心力衰竭分为射血分数降低型心衰、射血分数轻度下降型心衰和射血分数保留型心衰(HFpEF)。近年来，HFpEF的发病率明显增加，已占总心衰人数的50％以上，逐渐成为心血管疾病领域的研究重点。糖尿病是危害人类健康的重大慢性疾病，也是引起HFpEF的重要原因之一，合并糖尿病的HFpEF患者，心衰住院比例是非糖尿病的2.5倍，且伴有糖尿病的HFpEF患者具有更高的死亡率、更差的生活质量及预后，但其确切的病理机制尚未明确，难以在早期及时有效的预测、诊断和治疗。

目前对HFpEF诊断的方法主要是依据临床症状、心脏超声及NT-proBNP水平，其中前两项易受到人为主观因素以及测量标准不同的影响，造成诊断延迟或误诊，且针对不严重的心衰情况，诊断力有限。NT-proBNP检测虽然相对客观，但易受到年龄、感染、低氧血症、肾功能、肺功能等诸多因素的影响，对HFpEF患者病情程度的评估存在一定的局限性。现有技术的另一个缺点是只能对在患者目前的心脏结构和功能障碍进行诊断，并不能对未来是否具有恶化风险进行预测，达不到预防的效果。并且，以上方法并非特异性针对作为HFpEF的高发群体—糖尿病患者，因此寻找到检测糖尿病患者是否患有HFpEF且具有心功能评估和预后分析作用的快速、有效型检测试剂，对于疾病的早期检测和干预具有重大的意义。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供生物标志物在制备用于糖尿病患者HFpEF检测试剂中的应用，旨在解决现有检测方法无法做到早期识别早期检测，导致达不到预防HFpEF发生和预警心功能恶化等问题。

本发明的技术方案如下：

生物标志物在制备用于糖尿病患者HFpEF检测试剂中的应用，所述生物标志物为ITGA1蛋白。

生物标志物在制备用于糖尿病患者HFpEF检测试剂中的应用，其中，所述生物标志物还包括MYH11蛋白、IGF1R蛋白、HP蛋白和DES蛋白中的任意2种或2种以上蛋白的组合。

所述生物标志物在制备用于糖尿病患者HFpEF检测试剂中的应用，其中，所述生物标志物为ITGA1蛋白、MYH11蛋白、IGF1R蛋白、HP蛋白的组合。

所述生物标志物在制备用于糖尿病患者HFpEF检测试剂中的应用，其中，所述生物标志物为ITGA1蛋白、MYH11蛋白、IGF1R蛋白、HP蛋白和DES蛋白的组合。

所述生物标志物在制备用于糖尿病患者HFpEF检测试剂中的应用，其中，采集生物样品，通过检测方法检测所述生物样品中蛋白质或肽成分的浓度水平，将所述蛋白质或肽成分的浓度水平作为糖尿病患者HFpEF的检测指标；

所述检测方法选自高通量蛋白质组学、蛋白芯片、液相或气相色谱、质谱、与质谱联用的液相或气相色谱方法中的一种。

所述生物标志物在制备用于糖尿病患者HFpEF检测试剂中的应用，其中，采集生物样品，通过酶联免疫技术或多重微珠阵列测定技术对所述生物标志物中的各个蛋白进行检测，确定检测到的所述生物标志物中各蛋白浓度的变化。

所述生物标志物在制备用于糖尿病患者HFpEF检测试剂中的应用，其中，采集生物样品，通过荧光测定、免疫亲和、免疫化学、电泳或基于抗体的测定对所述生物标志物进行同时检测，确定检测到的所述生物标志物中各蛋白浓度的变化。

所述生物标志物在制备用于糖尿病患者HFpEF检测试剂中的应用，其中，所述生物样品选自个体全血、血清、血浆、血液衍生物、血液本身的样品蛋白质中的一种或两种以上的组合。

有益效果：本发明提供生物标志物在制备用于糖尿病患者HFpEF检测试剂中的应用，其中所述生物标志物为ITGA1蛋白，还包括MYH11蛋白、IGF1R蛋白、HP蛋白和DES蛋白中的任意2种或2种以上蛋白的组合。本发明将所述生物标志物用于制备检测糖尿病患者HFpEF的试剂，可以提高检测的客观性、特异性和准确性；并且，ITGA1蛋白作为检测靶点或检测目标能有效评估已合并HFpEF的糖尿病人群的心脏结构和功能损伤程度，并预测其心脏结构和功能是否存在进一步恶化风险，起到及时预警的作用，有助于该类人群在心功能发生不可逆损伤或恶化之前及时发现并尽早进行临床干预，可有效延缓病情发展和减少经济支出。同时，利用所述生物标志物用于制备糖尿病患者HFpEF检测试剂或者已合并HFpEF的糖尿病患者心脏结构和功能损伤程度评估和恶化风险预测的试剂时，具有无创、准确、早期并且精确度高的优点，适用于糖尿病患者的大范围筛查。

附图说明

图1为ITGA1、MYH11、IGF1R、HP和DES蛋白作为糖尿病患者HFpEF诊断的受试者工作特征曲线图；

图2为实施例2的非HFpEF和HFpEF组中ITGA1、MYH11、IGF1R、HP和DES蛋白的ELISA实验结果对比图；

图3为ITGA1蛋白作为糖尿病合并HFpEF患者心脏结构和功能损伤程度评估的受试者工作特征曲线图；

图4为实施例3的低ITGA1组与高ITGA1组糖尿病合并HFpEF患者心脏超声指标比较数据图；

图5为实施例3的低ITGA1组与高ITGA1组糖尿病合并HFpEF患者随访前后心脏超声指标比较数据图。

具体实施方式

本发明提供生物标志物在制备用于糖尿病患者HFpEF检测试剂中的应用，所述生物标志物为为ITGA1蛋白，还包括MYH11蛋白、IGF1R蛋白、HP蛋白和DES蛋白中的任意2种或2种以上蛋白的组合。将这些蛋白组合结合ITGA1蛋白，可以使得试剂对糖尿病患者是否患有HFpEF的检测更加精确。本发明还提供ITGA1蛋白作为检测靶点或检测目标用于已合并HFpEF的糖尿病人群心脏结构和功能损伤程度评估及恶化风险预测的试剂中的应用。为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)，具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语，应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样被特定定义，否则不会用理想化或过于正式的含义来解释。

现有试剂无法有效检测糖尿病患者是否合并HFpEF，从而不能有效评估患者心脏功能是否发生异常，并且，现有检测方法易受人为主观性、检测标准差异以及年龄、感染、低氧血症、肾功能、肺功能等诸多因素影响造成检测延迟或误诊的问题；另外，由于目前评估心脏结构和功能的方法是通过患者症状、体征和利用心脏彩超、核磁以及平板运动试验等技术方法，前者受到人为主观因素影响，后者不适用于大范围筛查，并且以上方法都只能对患者目前的心脏结构和功能进行诊断，并不能对未来是否具有恶化风险进行预测。

基于此，本发明提供生物标志物在制备用于糖尿病患者HFpEF检测试剂中的应用，所述生物标志物为ITGA1蛋白。

在本实施方式中，通过检测试剂检测受试者的生物样品中的生物标志物浓度水平，根据所述生物标志物的浓度水平的改变作为该受试者是否具有HFpEF的检测指标；本发明确定了可用于检测糖尿病患者是否同时患有HFpEF的检测试剂，将所述生物标志物用于制备糖尿病患者HFpEF的检测试剂，可提高检测的客观性、特异性和准确性；并且，ITGA1蛋白作为检测靶点或检测目标能有效评估已合并HFpEF的糖尿病人群心脏结构和功能的损伤程度评估并预测受试者心脏结构和功能是否具有恶化风险，起到及时预警的作用，有助于受试者在心功能发生不可逆损伤或恶化之前及时发现并进行临床干预，减少经济支出并改善预后。并且，本发明具有无创、准确、早期并且精确度高的有点，适用于糖尿病患者的大范围筛查。

在一些实施方式中，所述生物标志物还包括MYH11蛋白、IGF1R蛋白、HP蛋白和DES蛋白中的任意2种或2种以上蛋白的组合。将这些蛋白组合结合ITGA1蛋白，可以使得试剂对糖尿病患者是否患有HFpEF的检测更加精确。

在一些实施方式中，所述生物标志物为ITGA1蛋白、MYH11蛋白、IGF1R蛋白的组合；该组合用于制作糖尿病患者HFpEF检测试剂时，同样具有较佳的客观性、特异性和准确性。

在一些实施方式中，所述生物标志物为ITGA1蛋白、MYH11蛋白、HP蛋白的组合；该组合用于制作糖尿病患者HFpEF检测试剂时，具有较佳的客观性、特异性和准确性。

在一些实施方式中，所述生物标志物为ITGA1蛋白、MYH11蛋白、DES蛋白的组合；该组合用于制作糖尿病患者HFpEF检测试剂时，同样具有较佳的客观性、特异性和准确性。

在一些实施方式中，所述生物标志物为ITGA1蛋白、IGF1R蛋白、HP蛋白的组合；该组合用于制作糖尿病患者HFpEF检测试剂时，同样具有较佳的客观性、特异性和准确性。

在一些实施方式中，所述生物标志物为ITGA1蛋白、IGF1R蛋白、DES蛋白的组合；该组合用于制作糖尿病患者HFpEF检测试剂时，同样具有较佳的客观性、特异性和准确性。

在一些实施方式中，所述生物标志物为ITGA1蛋白、HP蛋白、DES蛋白的组合；该组合用于制作糖尿病患者HFpEF检测试剂时，同样具有较佳的客观性、特异性和准确性。

在一些实施方式中，所述生物标志物为ITGA1蛋白、MYH11蛋白、IGF1R蛋白、HP蛋白的组合；该组合用于制作糖尿病患者HFpEF检测试剂时，同样具有较佳的客观性、特异性和准确性。

在一些实施方式中，所述生物标志物为ITGA1蛋白、MYH11蛋白、IGF1R蛋白和DES蛋白的组合；该组合用于制作糖尿病患者HFpEF检测试剂时，同样具有较佳的客观性、特异性和准确性。

在一些实施方式中，所述生物标志物为ITGA1蛋白、MYH11蛋白、HP蛋白、DES蛋白的组合；该组合用于制作糖尿病患者HFpEF检测试剂时，同样具有较佳的客观性、特异性和准确性。

在一些实施方式中，所述生物标志物为ITGA1蛋白、IGF1R蛋白、HP蛋白、DES蛋白的组合；该组合用于制作糖尿病患者HFpEF检测试剂时，同样具有较佳的客观性、特异性和准确性。

在一些实施方式中，所述生物标志物为ITGA1蛋白、MYH11蛋白、IGF1R蛋白、HP蛋白、DES蛋白；该组合用于制作糖尿病患者HFpEF检测试剂时，同样具有较佳的客观性、特异性和准确性。

具体地，将受试者通过所述试剂检测到的生物标志物的蛋白含量与“诊断阈值”相比较，当所述生物标志物中的ITGA1蛋白、MYH11蛋白、IGF1R蛋白和HP蛋白含量水平高于“诊断阈值”时，可以作为该受试者患有HFpEF的检测指标；当所述生物标志物中的DES蛋白含量低于“诊断阈值”时，也可以作为该受试者患有HFpEF的检测指标。

需要说明的是，该“诊断阈值”的确定方法是通过测量已知患有HFpEF的糖尿病人群和未患有HFpEF的糖尿病人群血清中所述生物标志物的水平，以“敏感度”为纵坐标、“1-特异度”为横坐标，制作受试者工作特征曲线(ROC)，并计算该蛋白的曲线下面积(AUC)以及各浓度水平下该蛋白用于诊断的特异性和敏感性，利用约登指数计算该蛋白用于诊断的最佳“诊断阈值”。

具体地，所述糖尿病为由高血糖引起的相关疾病，例如1型糖尿病和2型糖尿病。所述HFpEF是指左心室舒张功能下降所导致左心充盈受阻，左心室射血分数值大于或等于50％的一种特殊类型的心力衰竭。

进一步地，本发明可通过下述方法检测该蛋白组合是否存在、浓度变化及表达量水平变化：

在一些实施方式中，采集生物样品，通过检测方法检测所述生物样品中蛋白质或肽成分的浓度水平，将所述蛋白质或肽成分的浓度水平作为糖尿病患者HFpEF的检测指标；所述检测方法选自高通量蛋白质组学、蛋白芯片、液相或气相色谱、质谱、与质谱联用的液相或气相色谱方法中的一种。

在一些实施方式中，采集生物样品，通过酶联免疫技术或多重微珠阵列测定技术对所述生物标志物中的各个蛋白进行检测，确定检测到的所述生物标志物中各蛋白浓度的变化。

在一些实施方式中，采集生物样品，通过荧光测定、免疫亲和、免疫化学、电泳或基于抗体的测定对所述生物标志物进行同时检测，确定检测到的所述生物标志物中各蛋白浓度的变化。

在一些实施方式中，所述生物样品选自个体全血、血清、血浆、血液衍生物、血液本身的样品蛋白质中的一种或两种以上的组合。

进一步地，将经上述方法检测并确定为患有HFpEF的糖尿病患者的ITGA1水平绝对值与“程度阈值”相比较，以评估受试者心脏结构和功能损伤程度及未来恶化风险。作为举例说明，当受试者ITGA1水平低于“程度阈值”证明存在I级心脏结构和功能损伤，且未来进一步恶化风险低；高于“程度阈值”证明存在II-III级心脏结构和功能损伤，且未来进一步恶化风险高。

需要说明的是，该“程度阈值”的确定方法是通过在已知患有HFpEF的糖尿病人群中测量心脏舒张功能I级和心脏舒张功能II-III级患者所述生物标志物的水平，如图3所示，以“敏感度”为纵坐标、“1-特异度”为横坐标制作ROC曲线，并计算AUC面积以及各浓度水平下该蛋白用于诊断的特异性和敏感性，利用约登指数计算该蛋白用于心脏功能评估的最佳“程度阈值”。

具体地，所述心脏舒张功能I级是指心脏舒张功能轻度减低，所述心脏舒张功能II-III级是指心脏舒张功能中-重度减低。

下面进一步举例实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

实施例1

在本实施例中，首先收集40例糖尿病患者血液标本，其中20例未合并HFpEF，20例合并HFpEF。

糖尿病诊断标准：当空腹血糖大于或等于7.0mmol/L；OGTT餐后两小时的血糖大于或等于11.1mmol/L。

HFpEF诊断标准：1)心力衰竭的症状和(或)体征；2)左心室射血分数≥50％，左心室无扩大；3)相关的结构性心脏病(左房扩大和/或左室肥厚)和(或)舒张功能不全包括：①舒张早期二尖瓣血流峰值(E)与舒张早期二尖瓣环心肌运动速度(e′)之比(E/e′)>15；②若8＜E/e′＜15,则同时满足NT-proBNP＞125pg/mL、超声血流多普勒检查E/A峰＜1、左房扩大、左室肥厚、存在心房颤动等中一项亦可判定为舒张功能不全。

排除标准：1)心脏超声提示：心脏瓣膜病、心包疾病、肥厚型心肌病、限制型心肌病的患者；2)急性心肌梗死、肺结核、慢性阻塞性肺疾病、肝肾功能衰竭、肿瘤、近1个月内有重大创伤、手术、感染、血液病、免疫性疾病等可能导致生物标志物水平变化的疾病。

(1)4℃，12000g离心10分钟，去除细胞碎片，上清液转移至新的离心管。利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。

(2)各样品蛋白取等量进行酶解，加入适量标准蛋白，用裂解液将体积调整至一致，再加入二硫苏糖醇(DTT)使其终浓度为5mM，56℃还原30min。之后加入碘乙酰胺(IAA)使其终浓度为11mM，室温避光孵育15min。将烷基化好的样本转移至超滤管，室温12000g离心20min，用8M尿素置换3次，再用置换buffer置换尿素3次，以1:50的比例加入胰蛋白酶，酶解过夜。室温12000g离心10min回收肽段，再用超纯水回收肽段一次，合并两次肽段溶液。

(3)肽段用液相色谱流动相A相溶解后使用EASY-nLC 1200超高效液相系统进行分离。流动相A为含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液；流动相B为含0.1％甲酸和90％乙腈的水溶液。液相梯度设置：0-50min，4％～20％B；50-62min，20-32％B；62-66min，32％～80％B；66-70min，80％B，流速维持在500nL/min。肽段经由超高效液相系统分离后被注入NSI离子源中进行电离，然后进入Orbitrap Exploris

(4)基于质谱检测得到的Raw文件

1)根据样本的来源情况构建样本特异性蛋白数据库，然后采用分析软件进行数据库搜索；搜库结果中给出了每个蛋白在不同样本中的LFQintensity(蛋白原始Intensity值在样本之间校正后的结果)。将蛋白在不同样本中的LFQ intensity(I)通过中心化变换，得到蛋白在不同样本中的相对定量值(R)，计算公式如下，其中i表示样本，j表示蛋白。

Rij＝Iij/Mean(Ij)

2)基于数据库搜索的结果进行肽段和蛋白水平的质控分析。

3)对鉴定到的蛋白进行常见功能注释，包括GO、KEGG、Proteindomain、COG/KOG、STRING数据库注释等。

4)进行蛋白的定量分析，包括定量分布和重复性分析。

5)根据定量结果进行差异筛选。具体来讲，挑出需要比较的样本，将每个蛋白在多次重复样本中的相对定量值均值之比作为差异倍数(FoldChange，FC)。为了判断差异的显著性，将每个蛋白在比较组样本中的相对定量值进行T检验，计算相应的P value，以此作为显著性指标，默认Pvalue<0.05。为了让检验数据符合T检验需求的正态分布。检验前，蛋白相对定量值需要经过Log2对数转换。将Fold change(FC)绝对值>1.2以及P value<0.05设定为差异蛋白的阈值，共识别出235个HFpEF相关的差异表达蛋白。

6)对差异蛋白进行功能分类统计分析，包括GO二级分类、亚细胞定位分类、COG/KOG分类统计。

7)基于不同分类方法得到的统计结果，采用费希尔精确检验(Fisher’s exacttest)方法进行富集分析。

8)通过富集聚类分析比较不同实验条件下的差异蛋白在功能上的联系。

9)通过蛋白互作网络(PPI)分析，筛选出特定实验条件下的关键调控蛋白。

(5)根据上述方法共发现8个蛋白组间差异显著且富集在心功能相关通路，将这8个蛋白作为目标蛋白进行后续验证，该8个蛋白的计算预测与实验验证的结果比较详见表1。根据计算预测和试验验证相结合的方法，识别出可用于糖尿病患者HFpEF诊断的血液蛋白标志物：ITGA1蛋白、MYH11蛋白、IGF1R蛋白、HP蛋白和DES蛋白。

表1 8个HFpEF潜在的血液蛋白标志物的计算预测和实验验证结果

实施例2

在本实施例中，入选200例糖尿病患者，其中未合并HFpEF者100例，合并HFpEF者100例。

糖尿病诊断标准：当空腹血糖大于或等于7.0mmol/L；OGTT餐后两小时的血糖大于或等于11.1mmol/L。

HFpEF诊断标准：1)心力衰竭的症状和(或)体征；2)左心室射血分数≥50％，左心室无扩大；3)相关的结构性心脏病(左房扩大和/或左室肥厚)和(或)舒张功能不全包括：①舒张早期二尖瓣血流峰值(E)与舒张早期二尖瓣环心肌运动速度(e′)之比(E/e′)>15；②若8＜E/e′＜15,则同时满足NT-proBNP＞125pg/mL、超声血流多普勒检查E/A峰＜1、左房扩大、左室肥厚、存在心房颤动等中一项亦可判定为舒张功能不全。

排除标准：1)心脏超声提示：心脏瓣膜病、心包疾病、肥厚型心肌病、限制型心肌病的患者；2)急性心肌梗死、肺结核、慢性阻塞性肺疾病、肝肾功能衰竭、肿瘤、近1个月内有重大创伤、手术、感染、血液病、免疫性疾病等可能导致生物标志物水平变化的疾病。

(1)病史采集及一般处理：记录每位患者的年龄、性别、吸烟史、冠心病、高血压、糖尿病病史、心房颤动、心功能情况，每位患者常规检测血红蛋白、血肌酐、血尿酸、甘油三脂、总胆固醇、肝功能、心肌酶等检查。

(2)血清中所述蛋白组合检测：上述入组患者血清利用ELISA法检测所述生物标志物浓度，具体步骤为：1)包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释,一般为10微克/毫升，每孔加100微升，37℃温育1小时后，4℃冰箱放置过夜；2)洗涤：倒尽板孔中液体，加200微升洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽，扣干；3)加封闭液200微升，37℃放置1小时；4)洗涤同2；5)加被检血清：用稀释液将被检血清作1:1000、1:2000、1:4000、1:6000、1:8000、1:10000、1:20000、1:40000、1:80000稀释，每孔100微升。同时作稀释液对照，阴性血清按1:1000倍比稀释，37℃放置2小时；6)洗涤同2；7)加辣根过氧化物酶羊抗鼠IgG,每孔100微升,放置37℃1小时；8)洗涤同2，然后用ddH2O洗涤2次；9)加底物：每孔添加100微升TMB应用液，于暗室反应10～20min，显色蓝色可终止；10)加终止液：每孔50微升，反应3～5min；11)计算结果：用酶联免疫检测仪在波长450nm处观测OD值，并计算两组人群中所述标志物的相对含量，分析对比糖尿病组和糖尿病合并HFpEF组人群血清中所述生物标志物的水平，糖尿病合并HFpEF组ITGA1蛋白、MYH11蛋白、IGF1R蛋白和HP蛋白显著高于糖尿病组，DES蛋白显著低于糖尿病组(如图2所示)。

(3)所述蛋白组合评估：根据上述方法测量糖尿病组和糖尿病合并HFpEF组人群血清中所述生物标志物的水平，以“敏感度”为纵坐标、“1-特异度”为横坐标制作ROC曲线，计算所述生物标志物组合中各蛋白AUC面积分别为：ITGA1，0.91；MYH11，0.86；HP，0.85；IGF1R，0.84；DES，0.79(如图1所示)，可作为判断糖尿病受试者是否合并HFpEF的生物标志物，具有一定的特异性、敏感性和准确性。

实施例3

(1)在本实施例中，入选糖尿病合并HFpEF者100例，根据血清ITGA1“程度阈值”将受试者分为“低ITGA1组”和“高ITGA1组”，并行常规经胸心脏彩色多普勒超声心动图检查，根据指南应用超声：以标准胸骨旁长轴切面测量左房内径(LAD)、室间隔厚度(IVSD)、左室后壁厚度(LVPWD)、左室舒张末期内径(LVDD)和左室收缩末期内径(LVSD)；以双平面法(改良Simpson法)分别于收缩末期和舒张末期，在心尖四腔心及两腔心切面手动描记心内膜以计算左心室舒张末期容积(LVEDV)、左心室收缩末期容积(LVESV)和左室射血分数(LVEF)；脉冲多普勒在心尖四腔切面测二尖瓣口舒张早期最大血流速度(E峰)、舒张晚期最大血流速度(A峰)，计算E/A比值；组织多普勒超声舒张早期二尖瓣瓣环速度(e′),并计算E/e′比值，以上测量数据均为连续3个心动周期的平均值。对比两组人群上述心功能指标差异，结果显示，“高ITGA1组”患者的LAD、LVDD、LVDS、LVEDV、LVESV和E/E’显著高于“低ITGA1组”，LVEF、E/A、TDI e’lat和TDI e’sept显著低于“低ITGA1组”，表明血清ITGA1低于“程度阈值”的糖尿病合并HFpEF者心脏结构和功能存在轻度异常(I级)；血清ITGA1高于“程度阈值”的糖尿病合并HFpEF者心脏结构和功能存在中-重度异常(II-III级)，血清ITGA1水平可以很好的评估糖尿病合并HFpEF患者的心功能损伤程度(如图4所示)。

(2)随访18个月后，利用心脏超声检测上述“低ITGA1组”和“高ITGA1组”糖尿病合并HFpEF患者的上述心功能指标，结果显示，“低ITGA1组”的糖尿病合并HFpEF患者随访18月后心功能指标较基线水平无显著差异，而“高ITGA1组”的糖尿病合并HFpEF患者随访18月后心功能指标中LAD、LVPWD、LVDD、LVDS、LVEDV、LVESV较基线水平显著升高，EF％和E/A显著降低。以上结果证实，血清中ITGA1低于“程度阈值”的糖尿病合并HFpEF患者心脏结构和功能恶化不明显，血清中ITGA1高于“程度阈值”的糖尿病合并HFpEF患者心脏结构和功能恶化明显、预后差，ITGA1可以很好地评估糖尿病合并HFpEF患者心脏结果和功能是否存在恶化风险(如图5所示)。

综上所述，本发明提供的生物标志物在制备用于糖尿病患者HFpEF检测试剂中的应用，所述生物标志物为ITGA1蛋白，并包含MYH11蛋白、IGF1R蛋白、HP蛋白和DES蛋白中的任意2种或2种以上蛋白的组合。本发明将所述生物标志物用于制备检测糖尿病患者HFpEF的试剂，可以提高检测的客观性、特异性和准确性；并且，该蛋白组合中的ITGA1蛋白作为检测靶点或检测目标能有效诊断糖尿病合并HFpEF人群的心脏结构和功能损伤程度，并预测其心脏结构和功能是否存在进一步恶化风险，起到及时预警的作用，有助于该类人群在心功能发生不可逆损伤或恶化之前及时发现并尽早进行临床干预，可有效延缓病情发展和减少经济支出。同时，利用所述生物标志物用于制备糖尿病患者HFpEF检测试剂或者已合并HFpEF的糖尿病患者心脏结构和功能损伤程度评估和恶化风险预测的试剂时，具有无创、准确、早期并且精确度高的优点，适用于糖尿病患者的大范围筛查。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。