一种从南五味子中同时制备五味子甲素和五味子酯甲的方法

摘要

本发明公开了一种从南五味子中同时制备五味子甲素和五味子酯甲的方法，包括以下步骤：南五味子经提取后获得稠状物，然后经过大孔吸附树脂纯化、柱层析分离、用甲醇重结晶，同时获得五味子甲素和五味子酯甲；该方法制备工艺简单，制备量大，得到的样品纯度大于98％。

说明书

技术领域

本发明属于天然植物提取技术领域，尤其涉及一种从南五味子中同时制备五味子甲素和五味子酯甲的方法。

背景技术

中药五味子为木兰科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果实，习称“北五味子"。南、北五味子因其性味、归经和功效基本一致，长期以来被统称为五味子一直延用。但由于南北五味子的化学成分有所不同，《中国药典》(2020版一部)分别列出五味子(习称“北五味子”)、南五味子。南五味子为木兰科植物华中五味子SchisandrasphenantheraRehd.etWils的干燥成熟果实。具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心之功效，主要用于久嗽虚喘、梦遗滑精、遗尿尿频、久泻不止、自汗盗汗、津伤口渴、内热消渴及心悸失眠等症，与其它中药配伍用于治疗肝炎、肝肾功能不足、月经失调、神经衰弱等。化学和药理学研究表明，南五味子的主要活性成分包括五味子甲素、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子酯丙、五味子酚等联苯环辛烯类木脂素，这些成分具保肝降酶、抗炎、抗氧化等药理作用[王菊平，李小芹，李永春.五味子甲素对急性肝内胆汁淤积大鼠肝功能的保护作用研究.亚太传统医药，2018，14(06):32-33.王陈萍，宣东平，陈霞，乔进，窦志华.五味子醇甲和五味子甲素对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的保护作用及机制.中国临床药理学杂志,2019,35(08):791-794.沈伊依,曾智锐,雷珊,薛燕,江建新.五味子甲素抑制胰腺癌PANC-1细胞迁移和侵袭及其机制探讨.肿瘤,2019,39(10):775-783.张晓云,赵海梅,刘億,刘雪珂,刘馥春,陈芳,刘端勇.五味子甲素对结肠炎大鼠氧化应激水平的调控作用.中华中医药学刊,2020,38(02):166-169.梁晗业,徐志立,陶小军,肖洪贺,胡丽萍.五味子甲素对小鼠溃疡性结肠炎的治疗作用.中药药理与临床,2017,33(03):38-42.陈临溪，陆丽群，罗旭灵，李瑶，李兰芳，谢凤.含有五味子甲素的药物组合物及其用途.公开号为CN108685885A的专利申请。刘平，陈佳美，嵇强，黄成钢，肖准，付亚东，刘伟，田小亭，慕永平，张华.五味子酯甲在制备抗肝纤维化疾病的药物中的应用.公开号为CN109820847A的专利申请]。

目前，已有大量的专利文献报道了五味子木脂素和单体的提取分离方法[公开号为CN107468803A的专利申请公开了一种五味子活性提取物的制备方法。公开号为CN109820847A的专利申请公开了一种五味子酯甲在制备抗肝纤维化疾病的药物中的应用。公开号为CN111187151A的专利申请公开了一种从五味子中提取五味子甲素的工艺。公开号为CN104909995A的专利申请公开了一种五味子木脂素单一组分的制备。公开号为CN101709059A的专利申请公开了一种五味子单体成分的分离制备方法。公开号为CN104230680A的专利申请公开了一种制备高纯度五味子甲素的方法。公开号为CN101759681A的专利申请公开了一种五味子酯甲的制备方法]。这些文献报道的提取分离方法，有的步骤多，如公开号为CN107468803A的专利申请，包括回流提取、浓缩水沉步骤要求在8～15℃，1～3KPa条件下浓缩，在0～4℃常压下静置水沉，高速离心，柱层析吸附纯化，HPLC制备等步骤；有的用到特殊的化学试剂，如公开号为CN107468803A的专利申请中用到活性炭和氨基酸序列为QSGFCTSYCYCLSKFNLTICYCLHCSS的活性短肽；有的还需要专门的仪器设备，如公开号为CN101709059A的专利申请中用到的GS10A2型半制备型高速逆流色谱仪，大部分文献方法只制备得到单一成分或多个成分，但不适合大量样品的制备。

现有一些申请的专利，提取和分离纯化方法如下所示：

公开号为CN1813900A的专利申请公开了一种南五味子木脂素的提取物及其制备方法和用途：用6-15倍南五味子药材重量的水蒸馏药材1-6小时；过滤，剩余药渣；煎煮药渣10-60分钟，过滤；用体积为药材量5-15倍的75％重量以上的乙醇水溶液提取药渣，每次0.5-3小时，过滤获得滤液；将所得滤液过1-3倍药材量极性大孔吸附树脂吸附柱，获得流出液；用体积为树脂量1-5倍的75％重量以上的乙醇洗脱，获得洗脱液；合并流出液和洗脱液，获得液态南五味子木脂素提取物。提取物中的木脂素成分为脂溶性成分，采用极性大孔吸附树脂，醇提液直接上样，利用脂溶性成分不吸附，水溶性杂质吸附于树脂上达到除杂目的，收集流出液和洗脱液，得到南五味子木脂素有效部位。由于南五味子为果实类药材，木脂素成分为脂溶性成分，此方法水蒸馏和水煎煮药材后，药材易糊化，加入乙醇提取时乙醇浓度下降，有效成分提取不完全；另外使用极性大孔吸附树脂，上样液和洗脱液均收集，纯化效果不理想，因此，该方法提取率和有效部位含量均较低。

公开号为CN106266168A的专利申请公开了一种南五味子木脂素提取物的制备方法：采用乙醇水溶液回流提取南五味子药材，再制备上样溶液，将上样溶液过弱极性大孔吸附树脂柱，先以10-30％的乙醇进行洗脱除杂，然后用70-90％的乙醇洗脱，并收集乙醇洗脱液，将乙醇洗脱液过0.5-2倍药材重量的氧化铝吸附柱，收集流出液减压或常压回收溶剂，于60-100℃减压或常压干燥，获得南五味子木脂素提取物。公开号为CN106266168A的专利申请公开了一种采用乙醇水溶液回流提取南五味子药材，提取液回收有机溶剂加水稀释，过弱极性大孔吸附树脂柱，先采用低浓度乙醇洗脱，除去杂质，再用高浓度乙醇解吸弱碱性的脂溶性木脂素类有效成分，得到南五味子木脂素有效部位。此方法中提取液回收乙醇后加水稀释，提取物中含有大量的脂肪酸成分和木脂素成分，这些成分为脂溶性成分，不易溶入水，以水溶液的方式上样，很容易堵塞大孔吸附树脂柱。

公开号为CN110343115A的专利申请公开了一种五味子木脂素类成分的提取与含量测定的方法：包括如下步骤：1、五味子果实与乙酸乙酯按照1g：(1.5-6)mL的料液比混合，利用闪式提取器提取1-6次，每次30-100s，合并提取液；2、将步骤1获得的提取液浓缩后，去除乙酸乙酯，得到浸膏；3、然后经硅胶柱层析后梯度洗脱，制备获得五味子木脂素类成分。该方法所述的硅胶柱层析所用的洗脱剂为石油醚与乙酸乙酯的混合溶液，体积比分别为100:1，50:1，25:1，10:1，3:1，1:1，按照上述体积比反复依次进行梯度洗脱，合并组分相同的馏分，反复重结晶制备得到单一五味子木脂素类成分。该方法利用硅胶柱层析分离五味子木脂素成分，需要使用石油醚与乙酸乙酯混合液反复梯度洗脱，并且还需要反复重结晶才能得到纯度达98％以上的单一五味子成分，操作繁琐，不易实现大规模的制备。

发明内容

本发明的目的是提供一种从南五味子中同时制备五味子甲素和五味子酯甲的方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一方面提供了一种从南五味子中同时制备五味子甲素和五味子酯甲的方法，包括以下步骤：南五味子经提取后获得稠状物，然后经过大孔吸附树脂纯化、柱层析分离、用甲醇重结晶，同时获得五味子甲素和五味子酯甲；

所述大孔吸附树脂纯化的步骤如下：向获得的稠状物中加入稠状物5～10倍质量的50％乙醇热溶，过1～3倍南五味子药材质量的D101大孔吸附树脂柱，先用4～5倍树脂体积的50％乙醇洗脱，然后用6～9倍树脂体积的95％乙醇洗脱，收集95％乙醇洗脱液部分，减压浓缩得到浓缩物；

所述柱层析分离的步骤如下：将获得的浓缩物用石油醚和乙酸乙酯溶解，其中，石油醚和乙酸乙酯的体积比为(8～12):1，石油醚和乙酸乙酯的质量为第二步获得的浓缩物质量的10～30倍，上100～400目硅胶柱层析，浓缩物与硅胶的质量比为1:(10～30)，先用体积比为(8～12):1的石油醚和乙酸乙酯洗脱，直至有五味子甲素洗脱出现时，然后用体积比为(6～8):1的石油醚和乙酸乙酯洗脱，获得含有五味子甲素洗脱部分，改用体积比为(2～4):1的石油醚和乙酸乙酯洗脱，获得含有五味子酯甲洗脱部分，分别将含有五味子甲素和五味子酯甲洗脱部分浓缩至膏状物。

所述南五味子经提取后获得稠状物的步骤如下：将粉碎的南五味子用5～10倍药材质量的95％的乙醇加热回流1～3次，每次1～2小时，合并提取液，减压浓缩至稠状物。

所述粉碎的南五味子的目数为20目。

所述用甲醇重结晶的步骤如下：向获得的两份膏状物中分别加入5～12倍膏状物质量的甲醇加热溶解，培养结晶，分别析出五味子甲素和五味子酯甲晶体，再用甲醇重复结晶2次，收集析出的晶体，真空干燥，同时得到五味子甲素和五味子酯甲。

由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：

本发明从南五味子中同时制备五味子甲素和五味子酯甲的方法，操作简单，成本低，可实现大批量样品的制备。在制备过程中不需用到专有仪器设备和特殊溶剂，仅用到三种常规的试剂:乙醇、石油醚、乙酸乙酯，操作步骤简单，仅包括提取、提取物经大孔树脂纯化、一次柱层析、重结晶处理步骤，就可以进行大规模的样品制备同时得到五味子甲素和五味子酯甲，纯度均大于98％。

本发明从南五味子中同时制备五味子甲素和五味子酯甲的方法，采用95％乙醇回流提取南五味子药材，可以更完全的提取出脂溶性成分，减少水溶性成分的溶出，为后期纯化提供较小的工作量；提取液回收乙醇后，在浓缩物中加入50％乙醇溶解，过非极性大孔吸附树脂柱，并用一定量的50％乙醇洗脱，可以把大部分的大极性的成分除掉，而50％乙醇洗脱时五味子甲素和五味子酯甲吸附在柱子上，最后用95％乙醇洗脱。此方法纯化效果较好，不仅最大程度的除掉杂质，富集目标有效成分，还能节省洗脱溶剂的用量，缩短操作时间。

本发明中柱层析分离步骤中，在柱层析制备过程中仅用到常规的试剂，且操作步骤简单，就可以进行大规模的样品制备同时得到五味子甲素和五味子酯甲。

附图说明

图1是五味子甲素和五味子酯甲的结构式示意图。

图2为实施例3大孔吸附树脂洗脱的TLC色谱图。

图3为实施例3硅胶柱层析洗脱的TLC色谱图。

图4为实施例3制备的五味子甲素质谱图。

图5为实施例3制备的五味子酯甲质谱图。

图6为实施例3制备的五味子甲素核磁

图7为实施例3制备的五味子甲素核磁

图8为实施例3制备的五味子酯甲核磁

图9为实施例3制备的五味子酯甲核磁

图10为实施例3制备的五味子甲素和五味子酯甲高效液相色谱图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1

一种从南五味子中同时制备五味子甲素和五味子酯甲的方法，包括以下步骤：

第一步，药材提取：将粉碎至20目的1千克南五味子，用5倍药材质量的95％的乙醇加热回流3次，每次1小时，合并三次乙醇提取液，将乙醇提取液在60℃下减压浓缩至稠状物，回收乙醇。

第二步，大孔吸附树脂纯化：向第一步获得的稠状物中加入稠状物5倍质量的50％乙醇热溶，过装有1千克的D101大孔吸附树脂柱，先用5倍树脂体积的50％乙醇洗脱，然后用8倍树脂体积的95％乙醇洗脱，收集95％乙醇洗脱液，在60℃下减压浓缩得到浓缩物，回收乙醇；

第三步，柱层析分离：将第二步获得的浓缩物用石油醚和乙酸乙酯溶解，其中，石油醚和乙酸乙酯的体积比为10:1，石油醚和乙酸乙酯的质量为第二步获得的浓缩物质量的10倍，上300～400目硅胶柱层析(浓缩物与硅胶的质量比为1:10)，先用体积比为10:1的石油醚和乙酸乙酯洗脱，每份洗脱液收集体积为硅胶柱填料体积1倍，TLC检测，在紫外线分析仪254nm下观察，直至有五味子甲素洗脱出现时，然后用体积比为7:1的石油醚和乙酸乙酯洗脱，获得含有五味子甲素洗脱部分，改用体积比为3:1的石油醚和乙酸乙酯洗脱，获得含有五味子酯甲洗脱部分，分别将含有五味子甲素和五味子酯甲洗脱部分浓缩至膏状物；

第四步，重结晶：向第三步获得的两份膏状物中分别加入5倍膏状物质量的甲醇加热溶解，培养结晶，分别析出五味子甲素和五味子酯甲晶体，用甲醇重复结晶2次，收集析出的晶体，真空干燥，分别得到4.2g五味子甲素和3.2g五味子酯甲。

实施例2

一种从南五味子中同时制备五味子甲素和五味子酯甲的方法，包括以下步骤：

第一步，药材提取：将粉碎至20目的10千克南五味子，用10倍药材质量的95％的乙醇加热回流3次，每次1小时，合并三次乙醇提取液，将乙醇提取液在60℃下减压浓缩至稠状物，回收乙醇。

第二步，大孔吸附树脂纯化：向第一步获得的稠状物中加入稠状物10倍质量的50％乙醇热溶，过装有10千克的D101大孔吸附树脂柱，先用5倍树脂体积的50％乙醇洗脱，然后用8倍树脂体积的95％乙醇洗脱，收集95％乙醇洗脱液，在60℃下减压浓缩得到浓缩物，回收乙醇；

第三步，柱层析分离：将第二步获得的浓缩物用石油醚和乙酸乙酯溶解，其中，石油醚和乙酸乙酯的体积比为10:1，石油醚和乙酸乙酯的质量为第二步获得的浓缩物质量的10倍，上300～400目硅胶柱层析(浓缩物与硅胶的质量比为1:10)，先用体积比为10:1的石油醚和乙酸乙酯洗脱，每份洗脱液收集体积为硅胶柱填料体积1倍，TLC检测，在紫外线分析仪254nm下观察，直至有五味子甲素洗脱出现时，然后用体积比为7:1的石油醚和乙酸乙酯洗脱，获得含有五味子甲素洗脱部分，改用体积比为3:1的石油醚和乙酸乙酯洗脱，获得含有五味子酯甲洗脱部分，分别将含有五味子甲素和五味子酯甲洗脱部分浓缩至膏状物；

第四步，重结晶：向第三步获得的两份膏状物中分别加入10倍膏状物质量的甲醇加热溶解，培养结晶，分别析出五味子甲素和五味子酯甲晶体，用甲醇重复结晶2次，收集析出的晶体，真空干燥，分别得到45.2g五味子甲素和34.1g五味子酯甲。

实施例3

一种从南五味子中同时制备五味子甲素和五味子酯甲的方法，包括以下步骤：

第一步，药材提取：将粉碎至20目的20千克南五味子，用10倍药材质量的95％的乙醇加热回流3次，每次2小时，合并三次乙醇提取液，将乙醇提取液在60℃下减压浓缩至稠状物，回收乙醇。

第二步，大孔吸附树脂纯化：向第一步获得的稠状物中加入稠状物10倍质量的50％乙醇热溶，过装有20千克的D101大孔吸附树脂柱，先用5倍树脂体积的50％乙醇洗脱，然后用8倍树脂体积的95％乙醇洗脱，收集95％乙醇洗脱液，在60℃下减压浓缩得到浓缩物，回收乙醇；

第三步，柱层析分离：将第二步获得的浓缩物用石油醚和乙酸乙酯溶解，其中，石油醚和乙酸乙酯的体积比为10:1，石油醚和乙酸乙酯的质量为第二步获得的浓缩物质量的10倍，上300～400目硅胶柱层析(浓缩物与硅胶的质量比为1:10)，先用体积比为10:1的石油醚和乙酸乙酯洗脱，每份洗脱液收集体积为硅胶柱填料体积1倍，TLC检测，在紫外线分析仪254nm下观察，直至有五味子甲素洗脱出现时，然后用体积比为7:1的石油醚和乙酸乙酯洗脱，获得含有五味子甲素洗脱部分，改用体积比为3:1的石油醚和乙酸乙酯洗脱，获得含有五味子酯甲洗脱部分，分别将含有五味子甲素和五味子酯甲洗脱部分浓缩至膏状物；

第四步，重结晶：向第三步获得的两份膏状物中分别加入8倍膏状物质量的甲醇加热溶解，培养结晶，分别析出五味子甲素和五味子酯甲晶体，用甲醇重复结晶2次，收集析出的晶体，真空干燥，分别得到93.3g五味子甲素和70.4g五味子酯甲。

图1是五味子甲素和五味子酯甲的结构式示意图。

图2为实施例3大孔吸附树脂洗脱的TLC色谱图。1-6是50％乙醇洗脱，7是五味子甲素对照品，8是五味子酯甲对照品，9-16是95％乙醇洗脱。由图可以看出，在254nm吸收波长下，在所述洗脱条件下，50％乙醇5倍树脂体积的洗脱，五味子甲素及五味子酯甲未能被洗下，当洗脱体积达到6倍体积洗脱时，50％乙醇的洗脱条件下，五味子酯甲被洗下；7倍95％乙醇即可完全洗脱五味子甲素及五味子酯甲。

图3为实施例3硅胶柱层析洗脱的TLC色谱图。1-3是石油醚：乙酸乙酯＝10:1洗脱，4-10是石油醚：乙酸乙酯＝7:1洗脱，11-17是石油醚：乙酸乙酯＝3:1洗脱，18是五味子甲素对照品，19是五味子酯甲对照品。由图可以看出，在254nm吸收波长下，在所述洗脱条件下，五味子甲素及五味子酯甲得到较好的分离。

图4为实施例3制备的五味子甲素质谱图。图5为实施例3制备的五味子酯甲质谱图。五味子甲素和五味子酯甲的结构鉴定通过核磁共振谱和高分辨质谱确定，纯度含量通过高效液相色谱仪分析确定。五味子甲素高分辨质谱：HR-ESIMSm/z417.2283[M+H]

图6为实施例3制备的五味子甲素核磁

图8为实施例3制备的五味子酯甲核磁

图10为实施例3制备的五味子甲素和五味子酯甲高效液相色谱图。A是五味子甲素对照品高效液相色谱图，B是实施例3制备五味子甲素高效液相色谱图，C是五味子酯甲对照品高效液相色谱图，D是实施例3制备五味子酯甲高效液相色谱图。

本发明制备的五味子甲素和五味子酯甲含量测定，色谱条件：

仪器名称机型号：Agilent1200LC；

色谱柱：AgilentZobaxSB-C184.6x250mm5-Micron；

进样体积:20μL；

流动相:乙腈:水＝55:45；

检测波长:230nm；

流速:1ml/min；

柱温:35℃。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。