基于自噬途径诊断和治疗胶质瘤干细胞的试剂及其用途

摘要

本发明提供了靶向胶质瘤干细胞(GSC)中的分泌性自噬在治疗胶质母细胞瘤(GBM)中的应用。本文首次提出GBM中的GSC在辐照后能发生自噬水平的升高，高的自噬水平通过自噬性分泌途径促进了GSC中IL‑18的分泌。TCGA数据库分析显示IL‑18在GBM中高表达且与病人差的预后相关。考虑进一步通过靶向GSC中的分泌性自噬途径或分泌性自噬途径相关分子IL‑18可以增加GSC放疗敏感性，抑制GBM的恶性发展，从而为GBM提供新的治疗方向。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及基于自噬途径诊断和治疗胶质瘤干细胞的试剂及其用途。

背景技术

胶质母细胞瘤(GBM)是一种异质性和高度侵袭性的原发性脑肿瘤，患者生存期为14.6个月。GBM的标准治疗包括最大限度切除，随后进行放射治疗，同时使用烷化剂替莫唑胺(TMZ)。对于胶质瘤的治疗从最初的放疗、化疗、到放化疗联合，一些靶向药物如贝伐单抗的研发等，也经历了50多年的发展过程。但是目前临床上绝大部分病人治疗后还会经历复发进展的过程。考虑到GBM的高死亡率和对常规治疗的抵抗性，人们对提高GBM的治疗疗效的新方法有很大兴趣。

胶质瘤干细胞(GSC)是胶质瘤中的一个肿瘤细胞亚群，具有自我更新和多向分化能力，在胶质瘤的发展和复发中扮演着重要角色。GSC是引起胶质瘤放疗抵抗性的关键细胞群。手术未能完全切除的胶质瘤边缘细胞具有GSC特征，能引起胶质瘤的复发进展。因此GSC是有效治疗GBM的重要关注靶点。

已有证据表明放疗可激活自噬，自噬在肿瘤发生的不同阶段扮演重要作用。既具有促进肿瘤也具有抑制肿瘤的特性。临床实验结果表明自噬抑制剂并没有显著提高GBM患者的总生存期。在包括GBM在内的各种肿瘤中，自噬的多种作用被广泛报道，其中分泌性自噬在肿瘤治疗中的作用引起了极大关注。新近的研究揭示某些特定的无前导序列蛋白需要自噬泡膜结构包裹介导其出胞，这一过程称为分泌型自噬(Secretory autophagy)。自噬在蛋白质分泌和运输中的作用被认为是自噬机制的一个功能，将影响范围从细胞内区室扩大到细胞外环境。这一领域的重大突破之一是认识到非常规分泌的胞质蛋白的子集，如HMGB1、IL-18等，缺乏前导肽，因此不能进入内质网到高尔基体的分泌途径而通过自噬小体膜的包裹直接运送到细胞外。

人类IL-18基因前体形式是由193个氨基酸残基组成的缺乏信号肽、不具有生物学活性的前体多肽，其中含有1个36个氨基酸的引导序列，经IL-1β转化酶作用后去除引导序列，成为成熟的IL-18。T细胞、NK细胞、树突状细胞、关节软骨细胞、成骨细胞及滑膜成纤维细胞等均能分泌IL-18。一些报道也提到了，癌症细胞也可以分泌IL-18。IL-18是一种多功能因子，其生物学功能无种属特异性。早期研究发现中性粒细胞是其作用的靶细胞。随着研究的深入，发现IL-18能作用于不同细胞，它能促进炎性反应进程、刺激血管的形成、促进有丝分裂、调节宿主免疫功能等，与多种炎性反应性疾病、肿瘤、免疫性疾病的发生和发展密切相关。

已有文献报道，放疗后胶质瘤患者肿瘤中存在自噬激活现象。但辐照后GSC是否存在分泌性自噬尚未见报道。因为目前临床上靶向降解性自噬相关的药物作用效果有限，还亟待对GSC的分泌性自噬进行深入探究，以期开发出靶向GBM分泌性自噬途径相关的药物应用于临床。

发明内容

本发明首次提出了辐照后胶质母细胞瘤中的胶质瘤干细胞发生高的自噬水平。

本发明还首次提出了辐照后胶质瘤干细胞自噬水平升高，参与自噬泡中吞噬膜延伸的关键蛋白ATG5、ATG7，以及形成自噬小泡结构所必须的关键蛋白LC3B和Beclin-1的mRNA水平升高。其中自噬标志物LC3II/LC3I的蛋白水平逐渐升高，同时重要的自噬受体P62的逐渐降低与辐照后胶质瘤干细胞的自噬升高有关。

本发明还首次提出了辐照胶质瘤干细胞后，在收取的GSC上清中发现了释放的肿瘤相关自噬小体水平的升高。

本发明还发现IL-18是辐照处理之后mRNA水平升高最明显的分泌性自噬相关的分子。在自噬敲除之后，IL-18在细胞内的水平得到了显著的累积增加。生物信息分析发现IL-18在GBM中高表达且与病人差的预后相关。

因此可以考虑通过靶向胶质瘤干细胞中高的分泌性自噬来增加肿瘤的放疗敏感性，帮助患者获得更好的治疗效果。

具体来说，本发明提供以下技术方案：

一方面，本发明提供检测自噬的试剂在制备胶质母细胞瘤特别是胶质瘤干细胞的诊断或预后试剂盒中的用途。

在一些实施方案中，检测自噬的试剂包括检测P62、ATG5、ATG7、ATG8、LC3B、Beclin-1、IL-18的mRNA水平的试剂。

在一些实施方案中，检测自噬的试剂包括自噬相关抗体，优选抗P62抗体、抗ATG5抗体、抗ATG7抗体、抗ATG8抗体、抗LC3B抗体、抗Beclin-1抗体和抗IL-18抗体。

在一些实施方案中，所述试剂盒还包括稀释液、洗涤液、显色液、终止液。

另一方面，本发明提供IL-18抑制剂在制备降低放射性抵抗的药物中的用途。

在一些实施方案中，放射性抵抗为胶质母细胞瘤特别是胶质瘤干细胞的放射性抵抗。

在一些实施方案，IL-18抑制剂选自由以下组成的组：ICE抑制剂、抗IL-18抗体、抗任何一个IL-18受体亚基的抗体、IL-18受体信号通道抑制剂、能与IL-18竞争和阻断IL-18受体的拮抗剂、以及IL-18结合蛋白质、其具有相同活性的异构体、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性片段或循环变换衍生物。

另一方面，本发明提供敲低自噬基因的试剂在制备治疗胶质母细胞瘤特别是胶质瘤干细胞的药物中的用途。

在一些实施方案中，敲低自噬基因的试剂包括RNA干扰试剂、基因编辑试剂，优选地所述试剂为siRNA、shRNA、miRNA、反义寡核苷酸或引导Cas酶切割或结合所述自噬基因中的序列的向导RNA。

在一些实施方案中，所述自噬基因选自P62、ATG5、ATG7、ATG8、LC3B和Beclin-1。

另一方面，本发明提供抑制放疗抵抗的药物组合物，其中所述组合物包括敲低自噬基因的试剂，任选地所述自噬基因选自P62、ATG5、ATG7、ATG8、LC3B和Beclin-1。

另一方面，本发明提供了IL-18作为一种辐照后胶质瘤发生分泌性自噬标志物的用途。

定义

降解性自噬：细胞内降解性自噬是一种分解代谢途径，其特征是形成双膜囊泡，称为自噬体，它吞噬细胞质成分并将其运送到溶酶体进行降解。自噬是一种保守的蛋白水解机制，降解细胞质物质，包括细胞器。对维持细胞内稳态和保持细胞健康很重要；它可以被激活作为对不利环境条件的适应性反应，如营养缺乏、缺氧和不同类型的治疗压力。自噬与肿瘤密切相关。肿瘤发生发展的不同阶段总是伴随着自噬。一般情况下自噬指的是这种降解性自噬。

分泌性自噬：大多数真核分泌蛋白被赋予了N-末端信号肽，这使它们能够进入内质网(ER)，并通过高尔基体遵循明确的分泌途径运送到细胞外空间。然而，缺乏信号肽并因此不能进入内质网的胞质蛋白质，仍然从细胞中积极分泌以执行其细胞外生物学功能。这种现象被称为非常规分泌，包括几个不同的过程。非常规分泌的一种形式——分泌性自噬的最早例子之一是来自哺乳动物细胞的胞质蛋白IL-1β的输出。分泌性自噬是自噬的一种特殊形式，近些年来发现自噬的发生会引起一些相关分泌蛋白的分泌增加。揭示了某些特定的无前导序列蛋白需要自噬泡膜结构包裹介导其出胞，自噬机制不仅仅涉及炎症细胞因子IL-1β的非常规分泌。此外，还包括更广泛的胞质底物。分泌性自噬货物包括IL-18和HMGB1等。分泌性自噬在蛋白质分泌和运输中的作用被认为是自噬机制将直接影响范围从细胞内区室扩大到细胞外环境的功能。因为以往针对细胞内降解性自噬的临床药物并没有取得很好的疗效，所以分泌性自噬这种特殊的自噬形式在肿瘤治疗中的功能引起了极大关注。目前关于分泌性自噬在肿瘤中的研究还不广泛，它在胶质瘤的发生发展中的具体作用途径还未可知。

LC3B(Microtubule-Associated Proteins 1A/1B Light Chain 3B)：神经元微管相关MAP1A和MAP1B蛋白的亚基，参与微管组装，参与自噬体的形成。是自噬过程的关键成分。LC3是自噬标志物，自噬形成时，胞浆型LC3(即LC3-I)会酶解掉一小段多肽，转变为(自噬体)膜型(即LC3-II)，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。最新版自噬指南中也可以直接用LC3-II的水平来直接衡量自噬水平的高低。

P62：重要的自噬受体，也称为SQSTM1(Sequestosome 1)蛋白，参与多种细胞信号转导调控、氧化应激及自噬过程。

ATG5：自噬蛋白质ATG5存在于大部分真核生物中，相对保守，在自噬泡的形成过程中起重要作用。也是自噬标志物之一。

ATG7：编码泛素E1样连接酶，在ATG12与ATG5结合前激活ATG12，促进前吞噬体的扩张。也是自噬标志物之一。

Beclin-1：是Ⅲ类PI3K复合物的亚基，Beclin-1与自噬前体的结合启动自噬体的形成，因此该蛋白是自噬体形成所必须的。

肿瘤细胞释放自噬小体(TRAPs)：肿瘤细胞株培养上清及癌症患者恶性胸/腹水中提取到一种粒径在200-900nm之间且具有双层膜结构的LC3B+细胞外囊泡，命名为肿瘤细胞释放自噬小体(Tumor-cell released autophagosome,TRAPs)。

放疗抵抗：患者在接受放疗时候前期比较有效果，一段时间之后，往往会出现对放射治疗的耐受性，使得放射治疗对癌症的治疗效果不再明显。原因可能有多种，放射治疗后，肿瘤会通过多种方式(包括快速的DNA损伤修复、自噬等)帮助自身抵御外界压力存活下来，因此这部分细胞对放射治疗产生抵抗。

细胞裂解物：细胞裂解是一种广泛的细胞研究方法，裂解细胞获得的细胞内DNA、RNA、蛋白提取物都可以称为细胞裂解物。

有益效果

本发明首次证明了辐照后原位小鼠胶质瘤模型中有高的自噬水平，并且辐照GSC促进了分泌性自噬相关分子IL-18的分泌，且IL-18与病人差的预后相关。因此考虑分泌性自噬途径及相关分子可作为GBM潜在的治疗靶点，具有良好的实际应用价值。

附图说明

图1A示出了辐照和未辐照小鼠原位移植瘤中自噬指标的染色情况。

图1B示出了辐照和未辐照小鼠原位移植瘤中自噬指标的染色的统计图。

图2示出了蛋白免疫印迹检测胶质瘤干细胞GBM-GSC1的未分化状态(GSC)和分化状态的非胶质瘤干细胞(NSTC)的本底自噬水平情况。

图3示出了免疫印迹和实时荧光定量核酸扩增检测胶质瘤干细胞(GSC)辐照处理前后的自噬相关指标的表达情况。图3A为GBM-GSC1胶质瘤干细胞系中，接受不同辐照剂量(0、3、6、12Gy)辐照处理48小时后自噬水平呈现剂量依赖性升高；图3B为GBM-GSC2胶质瘤干细胞系中，接受不同辐照剂量(0、3、6、12Gy)辐照处理48小时后自噬水平呈现剂量依赖性升高；图3C为GBM-GSC1辐照后的ATG5、ATG7、ATG8和BECN1的mRNA相对表达升高，佐证了自噬水平的升高；图3D为GBM-GSC2辐照后的ATG5、ATG7、ATG8和BECN1的mRNA相对表达升高，佐证了自噬水平的升高。

图4示出了收取辐照和未辐照处理的GSC的上清，进行肿瘤释放的自噬小体(TRAPs)的鉴定的结果。发现辐照处理GSC后收取的上清中有自噬小体的关键标志物LC3II的高表达。图4A为GBM-GSC1胶质瘤干细胞系中辐照后肿瘤释放的自噬小体(TRAPs)的鉴定，细胞胞内发生自噬水平升高的同时，上清浓缩物鉴定中存在LC3II的高表达；图4B为GBM-GSC2胶质瘤干细胞系中辐照后肿瘤释放的自噬小体(TRAPs)的鉴定，同样上清浓缩物鉴定中存在LC3II的高表达。

图5示出了辐照引起分泌性自噬相关分子IL-18的增加。图5A示出了相比于其他自噬性分泌相关分子，辐照可以显著增加GBM-GSC1中IL-18的mRNA水平；图5B示出了，相比于其他自噬性分泌相关分子，辐照可以显著增加GBM-GSC2的IL-18的mRNA水平；图5C示出了通过免疫印迹，辐照可以增加自噬水平同时显著增加了IL-18在GBM-GSC1胞内的表达；图5D示出了辐照可以增加自噬水平同时显著增加IL-18在GBM-GSC2胞内的表达；图5E示出了辐照可以增加IL-18的GBM-GSC1的胞外分泌；图5F示出了，辐照可以增加IL-18的GBM-GSC2的胞外分泌；图5G示出了通过免疫荧光，辐照可以显著增加IL-18在GBM-GSC1胞内表达量；图5H示出统计图展示了免疫荧光中辐照显著增加GBM-GSC1 IL-18表达；图5I示出了通过免疫荧光，辐照可以增加IL-18在GBM-GSC2胞内表达量；图5J示出统计图展示了免疫荧光中辐照显著增加GBM-GSC2 IL-18表达，IL-18在细胞内表达的增多可能进一步导致其胞外分泌量升高；图5K示出了自噬基因敲低之后，IL-18无法分泌在细胞内受到累积。

图6示出了通过数据库分析，IL-18分子的高表达与病人差的预后相关。图6A示出了在TCGA生信数据库中分析得到，IL-18相比于非肿瘤组在GBM患者中高表达；图6B示出在TCGA数据库中，IL-18的表达水平与GBM的级别正相关；图6C示出在CCGA数据库中，IL-18的高表达与肿瘤患者的差的预后相关。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

本发明所用的主要材料如下：

BCA蛋白定量试剂盒购自Solario公司；WB化学发光显色底物(Super Signal Westchemiluminescent substrates)购自Biosharp公司；基质胶购自Corning；一抗Anti-P62抗体购自Sigma-Aldrich公司；一抗Anti-IL-18抗体购自proteintech公司；一抗Anti-LC3B抗体购自Sigma-Aldrich公司，用于测定LC3B的Western blot的所有实验；一抗Anti-LC3B抗体购自CST公司，用于测定LC3B的免疫荧光的所有实验；一抗anti-β-actin购自CellSignaling Technology公司；二抗Anti-mouse、二抗Anti-rabbit购自Cell SignalingTechnology公司。

Lysis配方如下：

20mM beat-GPA(梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，G0097)；200mM PMSF(Sangon Biotech，A610425-0005)；50mM Tris(Sangon Biotech，A501492-0005)-HCL(国药集团化学试剂有限公司，I04328)PH7.4；150mM NaCl(Biosharp，BS112-1kg)；2mMEDTAPH8.0(Biosharp,BL518A)；1％NP-40(Sangon Biotech，A600385-0100)；0.1％ SDS(BioFROXX，3250GR500)；500mM Na3VO4(Sangon Biotech，A600869-0100)；500mM NaF(Sangon Biotech，A500850)；1M DTT(BioFROXX，111GR005)；1:50Cocktails(RocheDiagnosticsGmbH，11873580001)。

本发明涉及到的统计分析采用Graph Pad Prism统计学软件进行，两组均数比较采用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析，p<0.05认为具有统计学差异，并用“*”表示。图1-6中，*表示有统计学差异(p<0.05)；**表示有显著差异(p<0.01)；***表示有明显显著差异(p<0.001)；****表示有极为显著差异(p<0.0001)。

实施例1：辐照后的小鼠原位移植瘤组织有着更高的自噬水平

将GSC来源的小鼠原位肿瘤模型的未辐照组组织和辐照组的组织的冰冻切片进行免疫荧光染色。免疫荧光步骤为：

(1)将冰冻切片的组织用多聚甲醛室温固定0.5h；

(2)固定结束用PBS洗三次，每次5min；

(3)配制碱性修复液(Tris/EDTA buffer，pH 9.0)调节PH至9.0；

(4)用碱性修复液煮沸10min，等待其自然冷却；

(5)PBS洗三次，每次5min；

(6)用破膜封闭液(1％BSA/0.3％Triton X-100)对组织破膜封闭1h；

(7)PBS洗三次，每次5min；

(8)孵育Anti-LC3B一抗4℃过夜；

(9)PBS洗三次，每次5min；

(10)室温孵育荧光二抗，60min(荧光二抗是和一抗结合的抗体，上面带有可用激光激发的荧光基团，方便标志物的定位)；

(11)结束后使用PBS洗3次，每次5min；

(12)室温孵育Hoechst(一种用于染细胞核的荧光染料，Invitrogen，H3570)20min，结束后使用PBS洗3次，每次5min；

(13)使用封片剂(Sigma，F4680)进行封片；

(14)使用荧光显微镜进行观察。

图1A结果表明与未经过辐照的小鼠原位移植瘤组织相比，辐照后小鼠原位移植瘤组织有着更高的自噬水平。

图1B横坐标代表组别，纵坐标代表ATG5阳性细胞数目。经过统计，相比于对照未经过辐照的小鼠肿瘤组织，辐照后的肿瘤组织，ATG5指标有2倍水平的增多。

综上说明，辐照在GSC来源的小鼠原位肿瘤的组织中诱导出了更高的自噬水平；辐照带来的应激压力诱导的自噬可能发挥保护肿瘤细胞的功能，帮助肿瘤细胞减少应激压力带来的损伤。这种升高的自噬水平可能和胶质瘤放疗抵抗密切相关。

实施例2：胶质瘤干细胞(GSC)有着更高的自噬水平

将胶质瘤干细胞细胞系GBM-GSC1在1640培养基(BI，C3010-0500)进行分化培养7天。蛋白免疫印迹来检测GSC和NSTC的基本自噬情况。蛋白免疫印迹步骤如下：

(1)低速离心收取细胞沉淀，加入蛋白裂解液Lysis，冰上裂解30min；

(2)裂解后，取上清；BCA法定量样品蛋白浓度，加入4×SDS制备蛋白样；

(3)配制15％的分离胶，并按照10-40ug/孔蛋白量上样；

(4)80V 30min，120V 2h的电压进行电泳，确保LC3B的条带分离；

(5)PVDF膜放入甲醇中浸泡后置于电转液中，安装电转夹，恒流390mA冰浴湿转2h；

(6)结束后，将PVDF膜置于5％的脱脂奶粉中，室温封闭1h；

(7)孵育anti-LC3B一抗、anti-P62一抗、anti-Sox2一抗(GSC干性标志物)、anti-Olig2(GSC干性标志物)、anti-GFAP(GSC分化标志物)和anti-β-actin一抗(一种常用的内参蛋白)4℃摇床孵育过夜；

(8)一抗孵育完，TBST洗膜3次，每次5min；

(9)室温孵育二抗1小时(二抗是和一抗结合的抗体，二抗带有标记物辣根过氧化物酶，从而使二抗的信号可以被检测到)；

(10)结束后使用TBST洗膜3次，每次5min；

(11)显影曝光。

如图2所示，由GBM-GSC分化的GBM-NSTC条带中，代表干性的标志物Sox2和Olig2分别显著下调17.2和19.1倍，而分化标志物GFAP上升约9.1倍，GFAP代表一类分化细胞类型——星形胶质细胞亚群。这些指标的降低和升高说明GSC分化效果良好。且GBM-GSC与GBM-NSTC相比有着更高的自噬相关指标LC3B、P62的表达，分别为NSTC组的2.3和8.8倍。

综合以上结果可以得出，在GBM组织中，与普通的脑肿瘤细胞相比，胶质瘤干细胞可能具有更高的自噬水平。说明了研究GSC自噬的必要性。

实施例3：辐照诱导胶质瘤干细胞发生自噬水平升高

在小鼠体内发现辐照后自噬水平升高，紧接着探索辐照处理之后，是否有体外细胞模型中胶质瘤干细胞自噬的发生。取两种不同的胶质瘤干细胞细胞系(GBM-GSC1和GBM-GSC2)(细胞系制备方法参见：Zhou K,Yao YL,Ping YF,et al.VDAC2 interacts withPFKP to regulate glucose metabolism and phenotypic reprogramming of gliomastem cells.Cell Death Dis.2018Sep 24；9(10):988)，接受不同辐照剂量(0、3、6、12Gy)辐照处理48小时，收取细胞，并通过蛋白免疫印迹方法(具体实验步骤见实施例2)检测辐照对GBM-GSC1和GBM-GSC2的自噬水平的影响。Western blot(WB)是研究自噬最常用也是最直接的方法，通过检测Atg5、Atg7、Beclin1、LC3、P62等自噬相关蛋白的水平变化来评判自噬状态，其中用的最多的是LC3B和P62。微管相关蛋白1A/1B-轻链3(MAP1LC3)通常缩写为LC3，是自噬的关键组分。其在自噬体生物合成过程中掺入自噬体的内外膜。因此，LC3是自噬(尤其是自噬体形成)的特异性标志物。LC3会从胞液(LC3-I)形式逐步转化为膜结合的脂化形式(LC3-II)，这一过程被用于测定自噬的发生。脂化的发生加速了LC3-II条带在Western杂交中的迁移，因此能够区分LC3的膜结合和非膜结合形式。自噬发生过程中WB水平上有LC3-II/LC3-I的升高，在新版的自噬指南中认为单纯的LC3-II水平的升高同样指示着自噬水平的升高。同时这个过程一般同时伴随着自噬货物受体P62被运送到溶酶体中降解，P62蛋白水平降低。加以利用QPCR技术辅助检测辐照对GSC自噬水平的影响。指标包括参与自噬泡中吞噬膜延伸的关键蛋白ATG5、ATG7，以及形成自噬小泡结构所必须的关键蛋白基因ATG8和BECN1。

如图3A结果所示，辐照可以显著增加GBM-GSC1的自噬水平，并且呈现剂量依赖性。实验组相比较于对照组，LC3II/LC3I的转化逐渐升高，梯度剂量的辐照处理条件下，LC3II/LC3I的条带灰度值比值分别为0.082、0.12、0.27、0.50(见图)，代表自噬水平的逐渐升高；P62水平逐渐降低，实验组分别降低到对照组的0.54、0.49、0.47倍。

如图3B结果所示，辐照可以显著增加GBM-GSC2的自噬水平，并且呈现剂量依赖性。实验组相比较于对照组，LC3II/LC3I的转化逐渐升高；梯度剂量的辐照处理条件下，LC3II/LC3I的条带灰度值比值分别为0.033、0.17、0.23、0.33(见图)，代表自噬水平逐渐升高；P62水平逐渐降低，实验组分别降低到对照组的0.37、0.35、0.29倍。

图3C为GBM-GSC1的mRNA变化结果，横坐标为自噬相关基因的名称，纵坐标为处理组相比对照组的mRNA变化倍数，如图所示，辐照促进了自噬相关基因ATG5、ATG7、ATG8、BECN1的表达分别升高了1.7、1.2、2.4、2.2倍，并具有统计学差异。

图3D为GBM-GSC2的mRNA变化结果，横坐标为自噬相关基因的名称，纵坐标为处理组相比对照组的mRNA变化倍数，如图所示，辐照促进了自噬相关基因ATG5、ATG7、ATG8、BECN1的表达分别升高了1.3、1.8、2.3、1.2倍，并具有统计学差异。

综合结果可以得出，免疫印迹证明辐照处理可以诱导体外胶质瘤干细胞模型发生自噬。同样为了进一步佐证自噬确实发生，在QPCR系统中，在胶质瘤干细胞中也发现辐照处理之后，自噬相关基因mRNA水平的升高。自此也就证明了辐照模拟放疗确实可以在体外诱导胶质瘤干细胞自噬水平升高。

实施例4：辐照引起胶质瘤干细胞增强释放肿瘤相关自噬小体(TRAPs)

由实施例3我们知道辐照后胶质瘤干细胞中发生高的自噬水平，因此我们去检验是否肿瘤细胞上清中有肿瘤相关自噬小体(TRAPs)的增多。肿瘤相关自噬小体(TRAPs)会高表达LC3II。取两种不同的胶质瘤干细胞细胞系(GBM-GSC1和GBM-GSC2)接种于10cm培养皿，辐照6Gy处理GBM-GSC1和GBM-GSC2 48h。48h后收取细胞上清进行高速离心，并通过蛋白免疫印迹方法检测辐照对GBM-GSC1和GBM-GSC2的自噬小体外泌的影响。高速离心收取上清中的肿瘤释放自噬小体(TRAPs)，具体的实验步骤如下：

(1)将细胞培养上清倒入50mL离心管，1500rpm×10min，4℃；

(2)细胞用PBS洗2次，1500rpm×10min，4℃；

(3)将(1)、(2)离心所得上清液转移至新的50mL离心管中，12000rpm×15min，4℃；

(4)弃上清，沉淀用PBS洗1次，12000rpm×15min，4℃；

(5)通过WB鉴定了该成分上主要高表达自噬小体的关键组成成分LC3II，说明沉淀主要成分即为肿瘤释放自噬小体TRAP，用PBS重悬，分装，-20℃保存备用；

(6)BCA法定量样品蛋白浓度，加入4×SDS制备蛋白样；

(7)配制15％的分离胶，并按照40ug/孔蛋白量上样；

(8)80V 30min，120V 2h的电压进行电泳；

(9)PVDF膜放入甲醇中浸泡后置于电转液中，安装电转夹，恒流390mA冰浴湿转2h；

(10)结束后，将PVDF膜置于5％的脱脂奶粉中，室温封闭1h；

(11)孵育anti-LC3B一抗，4℃摇床孵育过夜；

(12)一抗孵育完，TBST洗膜3次，每次5min；

(13)室温孵育二抗1小时；

(14)结束后使用TBST洗膜3次，每次5min；

(15)显影曝光。

如图4A结果所示，辐照可以引起GBM-GSC1自噬小体(TRAPs)释放增多(S代表上清浓缩蛋白提取物，CL代表细胞裂解物中获取的蛋白。同时细胞内自噬水平也在辐照后升高，LC3II/LC3I比值由1.02升高到2.78。TRAPs的关键标志物LC3II在辐照组的上清中增多，WB图中显示出辐照组相比对照组升高了5.5倍。

4B结果所示，辐照可以引起GBM-GSC2自噬小体(TRAPs)释放增多(S代表上清浓缩蛋白提取物，CL代表细胞裂解物中获取的蛋白)。同时细胞内自噬水平也在辐照后升高，LC3II/LC3I比值由3.15升高到3.98。TRAPs的关键标志物LC3II在辐照组的上清中增多，WB图中显示出辐照组相比对照组升高了3.2倍。

综合结果可以得出，辐照引起胶质瘤干细胞增强释放肿瘤相关自噬小体(TRAPs)。我们首次提出了辐照可以增加胶质瘤干细胞的自噬小体(TRAPs)释放增多的理论；这为靶向辐照后胶质瘤分泌性自噬，增加胶质瘤的放疗敏感性提出了可能。

实施例5：辐照引起分泌性自噬相关分子IL-18的增加

由实施例4我们知道GSC中的自噬性分泌是治疗GBM的潜在靶点，因此我们去检验辐照后是否引起自噬性分泌相关分子的增加。

取两种不同的胶质瘤干细胞细胞系(GBM-GSC1和GBM-GSC2)接种于10cm培养皿，进行辐照处理,辐照剂量在QPCR和免疫荧光实验中对照组和实验组分别是0Gy和6Gy，在免疫印迹实验中为梯度剂量辐照处理，为0、3、6、12Gy。48h后收取细胞，并通过QPCR、蛋白免疫印迹方法和细胞免疫荧光的方法检测辐照对GBM-GSC1和GBM-GSC2的IL-18的影响。提取胞内蛋白进行蛋白免疫印迹方法检测辐照对GSC IL-18胞内表达的影响。此步骤的蛋白免疫印迹方法见实施例2。

提取上清蛋白并进行蛋白免疫印迹方法检测辐照对GSC IL-18细胞外分泌的影响，具体的实验步骤如下：

(1)传代细胞，120万细胞/10cm皿，补充6ml空的NBM培养基(美国Gibco公司，货号12348017)

(2)过夜培养后1000rpm高心3分钟收集细胞，然后取上清4500rpm高速离心3分钟去除细胞碎片，取上清使用10kD浓缩管8000rpm高速离心30分钟浓缩；

(3)浓缩后的上清加5×loading(终浓度1×)100℃金属浴煮样10min；

(4)制胶，用12％的胶(双蒸水，30％Acrylamide，10％过硫酸铵，TEMED，

4ⅹTris-HCl)进行western杂交，并按照10-40ug/孔蛋白量上样；

(5)80V 30min，120V 1h的电压进行电泳；

(6)PVDF膜放入甲醇中浸泡后置于电转液中，安装电转夹，恒流390mA冰浴湿转2h；

(7)结束后，将PVDF膜置于5％的脱脂奶粉中，室温封闭1h；

(8)孵育anti-IL-18，4℃摇床孵育过夜；

(9)一抗孵育完，TBST洗膜3次，每次5min；

(10)室温孵育二抗1小时，(二抗是和一抗结合的抗体，二抗带有标记物辣根过氧化物酶，从而使二抗的信号可以被检测到)；

(11)结束后使用TBST洗膜3次，每次5min；

(12)显影曝光。

利用细胞免疫荧光技术检测辐照对GSC IL-18分泌的影响，具体的实验步骤如下：

(1)第一天：在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；

(2)用4％的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min；

(3)0.5％Triton X-100(PBS配制)室温通透20min；

(4)PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加1％BSA，室温封闭30min；

(5)吸水纸吸掉封闭液，每张玻片滴加足够量的稀释好的anti-IL18一抗并放入湿盒(一种存放通用载玻片的黑色盒子，可以减少实验过程中的水分蒸发)，4℃孵育过夜；

(6)第二天：加荧光二抗(荧光二抗是与一抗上的目标蛋白进行结合的抗体。荧光二抗通常与荧光基团偶联用于定位和定量目标蛋白)：PBST浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行；

(7)复染核：滴加Hoechst(一种用于染细胞核的荧光染料，Invitrogen，H3570)避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI(防止DAPI染色过重，污染背景)；

(8)用吸水纸吸干爬片上的液体，使用封片剂(Sigma，F4680)进行封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

利用ATG7自噬基因敲低探究自噬对GSC IL-18分泌的调控，具体的实验步骤如下：

(1)取胶质瘤干细胞细胞系GBM-GSC1进行自噬关键基因的敲低；

(2)获得表达shATG7(ATG7的RNA干扰质粒pSUPER_ATG7

siRNA)和非靶向的shRNA(小干扰RNA)的慢病毒质粒(质粒来自于中国科学技术大学生命科学院吴缅老师课题组赠予)，shRNA质粒加入LB摇菌小抽后继续转化后中抽质粒，得到浓度较高的质粒，加入293T细胞进行病毒包装。

(3)接着包装好的病毒感染胶质瘤干细胞，胶质瘤干细胞在传代处理时，细胞数按100万/皿进行。包装好的慢病毒与NBM培养基以1:1的比例感染胶质瘤干细胞。

(4)8小时候后更换新鲜NBM培养基，待胶质瘤干细胞成球后进行解离传代，并添加嘌呤霉素筛选得到稳定转染的细胞系，嘌呤霉素与总培养基的比例是1：1000。

(5)为得到敲低效果更好的细胞系，可以用嘌呤霉素筛选两次，得到自噬基因ATG7敲低的胶质瘤干细胞系。

如图5A结果所示，相比于其他自噬性分泌相关分子，辐照可以显著增加GBM-GSC1的IL-18的mRNA水平，大约有3.5倍的升高变化；

如图5B结果所示，相比于其他自噬性分泌相关分子，辐照可以显著增加GBM-GSC2的IL-18的mRNA水平，大约有3.7倍的升高变化；

图5C通过免疫印迹看出，辐照可以增加自噬水平同时显著增加IL-18的GBM-GSC1胞内表达，在逐渐增加的辐照剂量3Gy、6Gy、12Gy照射下，IL-18的胞内表达水平相比于对照组有2.1、4.7、5.4倍水平的升高。

如图5D结果所示，辐照可以增加自噬水平同时显著增加IL-18的GBM-GSC2胞内表达，在逐渐增加的辐照剂量3Gy、6Gy、12Gy照射下，IL-18的胞内表达水平相比于对照组有3.1、4.9、7.3倍水平的升高。

如图5E结果所示，辐照可以增加IL-18的GBM-GSC1胞外分泌，大约有2.5倍的胞外水平增加。

如图5F结果所示，辐照可以增加IL-18的GBM-GSC2胞外分泌，大约有2.9倍的胞外水平增加。

图5G通过免疫荧光可以看出，辐照可以增加IL-18的GBM-GSC1胞内表达量。

图5H通过免疫荧光统计图可以看出，横坐标为组别，纵坐标为荧光强度。辐照可以增加IL-18的GBM-GSC1胞内量，升高在2.9倍左右。

如图5I结果所示，辐照可以增加IL-18的GBM-GSC2胞内表达量。

图5J通过免疫荧光统计图可以看出，横坐标为组别，纵坐标为荧光强度。辐照可以增加IL-18的GBM-GSC2胞内量，升高在3.6倍左右。

图5K结果所示，发现胶质瘤干细胞细胞系GBM-GSC1自噬关键基因ATG7敲低后，shATG7-6下调7.8倍，shATG7-9下调4.3倍。自噬明显受到抑制，表现在LC3II在敲低组中明显降低，IL-18在细胞内的累积明显增多，说明IL-18在自噬基因敲低后分泌受到阻滞，且IL-18的分泌受到自噬的严格调控。shATG7-6组在细胞内的IL-18累积有8.9倍的升高，shATG7-9组在细胞内的IL-18累积有6.4倍的升高。

综合结果可以得出，通过多种实验方法证明了辐照可以显著增加GSC IL-18的胞内表达和细胞外分泌水平，且IL-18的分泌受到自噬的严格调控。我们首次提出了辐照通过GSC自噬-外泌途径从而增加IL-18分泌的理论，证明了IL-18分子是靶向GSC分泌性自噬途径从而治疗GBM的潜在靶点。

实施例6:证明IL-18在GBM中的高表达与病人的差的预后相关

由实施例5我们知道IL-18分子是靶向GSC分泌性自噬途径从而治疗GBM的潜在靶点；我们接下来想进一步去验证IL-18的表达是否在GBM中是一种预后差的特征；

图6A证明了在TCGA生信数据库中分析得到，IL-18相比于非肿瘤组在GBM中高表达。

图6B证明了在TCGA生信数据库中分析得到，IL-18在GBM中的表达与GBM患者的肿瘤级别呈现正相关。

图6C在CCGA数据库中分析发现，IL-18的高水平与肿瘤患者的差的预后相关。

综合结果可以得出，IL-18高的表达水平与GBM患者差的表现相关。更好的证明了IL-18分子是靶向GSC分泌性自噬途径从而治疗GBM的潜在靶点。

综上所述，本发明首次提出了GBM中的GSC在辐照后可以产生高的自噬水平，可能与GBM预后不良相关。靶向GSC中高的自噬性分泌是治疗GBM的潜在治疗靶点。本发明还首次提出来IL-18分子是靶向GSC分泌性自噬途径从而治疗GBM的潜在靶点。可以通过阻断放疗后的分泌性自噬途径或者分泌性自噬途径分泌的相关分子IL-18，抑制胶质瘤的恶性进展，改善放疗抵抗。总之，本发明为治愈胶质母细胞瘤及提高胶质母细胞瘤的生存率提供新的方向。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。